4. Retinoik Asidin.FH10
Transkript
4. Retinoik Asidin.FH10
ARAÞTIRMALAR (Research Reports) Retinoik Asidin Prenatal Dönemdeki Endokondral Kemikleþme Üzerine Etkileri The effects of retinoic acid on endochondral ossification during prenatal development Neriman Çolakoðlu, Assoc. Prof. MD., Department of Histology and Emriyology, Fýrat University Medical Faculty, nerimancolakoglu@yahoo.com Ayþe Murat Aydýn, Assist. Prof. MD., Department of Radiodiagnostic Fýrat University Medical Faculty, amurat@fýrat.edu.tr Hatice Banu Özel, Dr. MD., Department of Histology and Emriyology, Fýrat University Medical Faculty, bunuuysal@yahoo.com Özet Amaç:Bu çalýþmada yüksek doz all-trans retinoik asidin sýçan fetuslerinde endokondral kemikleþme üzerine olan etkilerinin araþtýrýlmasý amaçlandý. Gereç ve Yöntemler:Bu çalýþmada 9 adet gebe Wistar-Albino cinsi ergin sýçanlar kullanýldý. Gebe sýçanlar 3 gruba ayrýldý. I. Grup kontrol olarak kullanýldý. II. Grup deneklere gebeliðin 12. gününde nörülasyon (prenatal 8.5-11.5 günler arasý nörülasyonun baþlangýç ve bitiþ günleri olarak tespit edildi) sonrasý III. Grup deneklere ise gebeliðin 8. gününde (nörülasyon öncesi) tek doz 60mg/kg all-trans retinoik asit gavaj yapýlarak uygulandý. Bütün gebe sýçanlara gebeliklerinin 18. gününde servikal dislokasyon yapýldý ve her gruptan 6 fetus bu çalýþma için kullanýldý. Iþýk mikroskobik ve radyografik teknikler kullanýlarak fetal vertebralardaki kemikleþme incelendi. Bulgular:Osteoblastik aktivite ve kemikleþen alanlar I. grupta belirgindi. II. grupta kemikleþme baþlamasýna raðmen III. grup vertebralarda kemikleþme belirtileri gözlenmedi. II. gruptaki kemikleþen alanlar I. gruba göre daha az olarak ayýrt edildi. Sonuç:Mevcut bilgiler ýþýðýnda nörülasyondan önce uygulanan yüksek doz all-trans retinoik asidin kemik morfogenezisini bozduðu fakat nörülasyon sonrasý uygulanan all-trans retinoik asidin kemik oluþumu sýrasýnda daha az yan etki gösterdiði söylenebilir. Anahtar Kelimeler: Fetus; Kemik; Osteogenezis; Retinoik asit. Enver Ozan, Prof. MD., Department of Histology and Emriyology, Fýrat University Medical Faculty, ezon@fýrat.edu.tr Aysel Kükner, Prof. MD., Department of Histology and Emriyology, Abant Ýzzet Baysal Medical Faculty, akukner@hotmail.com This manuscript can be downloaded from the webpage: http://tipdergisi.erciyes.edu.tr/project6/2007;29(4)280-284.pdf Submitted Revised Accepted : November 8, 2006 : March 5, 2007 : April 5, 2007 Abstract Purpose: The aim of this study was to investigate the effects of excess all-trans retinoic acid on endochondral ossification in fetuses of rats. Material and Methods: Nine Wistar-Albino pregnant rats were used in this study. Pregnant rats were divided into three groups. The first group of rats were used as control. The second group were fed by gavage a single dose of 60 mg/kg all-trans retinoic acid on day 12 of gestation after neurulation which began 8.5 day of gestation and finished 11.5 day of gestation whereas third group received same dose all-trans retinoic acid on day 8 of gestation (before neurulation). All pregnant rats were sacrificed at day 18 of gestation. Six fetuses from each group were used. Ossification of fetal vertebrates was light microscopically and radiographycally determined. Results: Osteoblastic activity and ossified areas were significant in group-I. Ossification signs were not evident in group-III whereas ossification in vertebrates begun in group-II . However, ossified areas of group-II were less than those of group-I. Conclusion: In view of present findings, we suggest that administration of excess all-trans retinoic acid prior to neurulation disrupted bone morphogenesis. However, its administration following neurulation had less adverse effect on bone formation. Key Words:Bone; Fetus; Osteogenesis; Retinoic acid. Corresponding Author: Neriman Çolakoðlu, Departman of Histology and Emriyology, Fýrat University Medical Faculty, Elazýð, Turkey Telephone E-mail 280 : +91 -xxx : nerimancolakoglu@yahoo.com Erciyes Týp Dergisi (Erciyes Medical Journal) 2007;29(4):280-284 Neriman Çolakoðlu, Ayþe Murat Aydýn, Hatice Banu Özel, Enver Ozan, Aysel Kükner Giriþ Kemiðin fetal geliþimi iki þekilde olmaktadýr. Her iki þekilde de primitif kollagenöz destek dokusunun yerini kemik dokusuna býrakmasý söz konusudur. Uzun kemikler, vertebra, pelvis ve kafatasý kemiðinin tabanýný oluþturan kemikler için sürekli büyüyen bir kýkýrdak model oluþur ve bu kýkýrdak daha sonra yerini kemiðe býrakýr. Bu geliþim süreci endokondral kemikleþme olarak bilinir. Kafatasýnýn yassý kemikleri, maxilla, mandibulanýn büyük kýsmý ise primitif mezenþim dokusunun direkt kemik dokusuna dönüþümü ile þekillenir. Bu tip kemikleþme ise intramembranöz kemikleþme olarak bilinir (1). Endokondral kemikleþme sýrasýnda kondrositler proliferasyon, olgunlaþma, hipertrofi, matriks vezikül biyogenezisi ve apoptozisi içeren aþamalardan geçmektedir. Bu olaylar dizisi kýkýrdak dokusunun yerini kemik dokusuna býrakmasýyla sonlanýr. Çoðalan kondrositler çoðunlukla proteoglikan ve tip II kollagenden oluþan ekstrasellüler matriksi sentezlerler (2). Kondrositlerin olgunlaþmasý; hücresel büyüklükteki artýþ (hipertrofi), ve alkalin fosfataz aktivitesi ve tip X kollagen gibi hipertrofinin fenotipik belirteçlerinin ekspresyonu ile birlikte seyreder (2-7). Alkalin fosfataz aktivitesi ve tip X kollagen ekspresyonu matriks mineralizasyonunu düzenler (3-7). Kondrosit olgunlaþmasý baþta bone morfogenetik protein (BMP) ve paratiroid hormonu ile iliþkili proteinler olmak üzere birçok otokrin ve parakrin faktör tarafýndan düzenlenmektedir (2). Endokondral kemikleþme sýrasýnda kondrositlerin çoðunluðu apoptozis ile ölmekte, mineralize matriks osteoklastlar tarafýndan sindirilmekte ve kondrositlerin bir kýsmý fenotipik kemik hücrelerine (osteoblast benzeri hücreler) farklanabilmektedir (8). Ýnvivo kemik geliþimi oldukça kompleks bir fenomendir. Osteogenezis; osteoblastlarýn mezenþimal prekürsörlerinin çoðalýp sýrasýyla preosteoblastlara (osteoprogenitör hücrelere), osteoblastlara ve olgun osteoblastlara farklýlaþýp ekstraselüler matriksin birikip mineralize olmasýyla sonuçlanýr (9). Retinoidler olarak adlandýrýlan A vitamini ve metebolitleri fizyolojik konsantrasyonlarda büyüme, hücresel farklýlaþma, üreme (10, 11) gibi organizmanýn normal fonksiyonlarýnýn düzenlenmesinde rol oynamaktadýrlar. Aktif A vitamini meteboliti olan all-trans retinoik asit (atRA) omurgalýlarýn embriyonik geliþimleri sýrasýnda hücresel farklýlaþmada, morfogenezisde retinolden çok daha aktiftir (12). Genetik analizler retinoik asit reseptörlerinin (RAR) yokluðunda kýkýrdak oluþumunda ciddi yetersizlik olduðunu göstermiþtir. Transgenik farelerin geliþen ekstremitelerinde aktif RARlar negatif veya zayýf Erciyes Týp Dergisi (Erciyes Medical Journal) 2007;29(4):280-284 olarak eksprese olduklarýnda kondrogeneziste problem olmakta ve iskelet malformasyonlarý oluþmaktadýr. Bu sonuçlar RAR ile ilgili sinyallerin iskelet geliþiminde önemli rol oynadýðýnýn göstergesidir. RARlar kondroblast farklýlaþmasýný düzenlemekte ve retinoik asit (RA) sinyaline iþtirak ederek iskelet taslaðýnýn apozisyonel büyümesinde rol oynamaktadýrlar (13). Prenatal geliþim sýrasýnda bir morfogen olarak hareket eden retinoik asit, gebeliðin erken dönemlerinde yüksek dozda uygulanmasýna baðlý olarak teratojenik etki de göstermektedir. Maternal yüksek doz RA omfalosel, ekzensefali, ekzoftalmus ve ekstremite kýsalýðý gibi defektlere yol açmaktadýr (14). Bu çalýþmada prenatal geliþimin farklý iki döneminde uygulanan atRAin endokondral kemikleþme üzerine olan etkilerinin ýþýk mikroskobik ve radyolojik olarak belirlenmesi amaçlandý. Yöntem ve Gereçler: Araþtýrma, aðýrlýklarý 250-270 gr olan 9 adet WistarAlbino cinsi ergin (3 aylýk) diþi sýçanlar üzerinde gerçekleþtirildi. 22 ± 2 0C oda ýsýsýnda 12 saat ýþýk (7:0019:00) ve 12 saat karanlýkta (19:00-7:00) tutulan sýçanlar, özel olarak yaptýrýlan kafeslerde beslendi. Maternal All-trans Retinoik Asit Uygulanmasý Çalýþmada kullanýlan sýçanlara her gün 8.00 - 9.30 saatleri arasýnda vajinal smear yapýldý. Proöstrüs evresinde olduðu tespit edilen sýçanlar, ayný günün akþamý erkek sýçanlarla 1:1 þekilde eþlenip ayný kafese konuldu. Ertesi gün sabah saat 7.00da erkek ve diþi sýçanlar ayrýldý. Yapýlan vajinal smear sonrasý sperm (+) olarak tespit edilen sýçanlarýn gebeliðin 0. gününde olduklarý kabul edildi. Gebe olduðu saptanan 9 adet sýçan 3 ana gruba ayrýldý. I.Grup: Kontrol grubu normal beslenen gebe sýçanlara (n=3) gebeliklerinin 18. gününde servikal dislokasyon uygulandý. Midsaggital insizyonla fetusleri alýndý. Bu fetuslerden rastgele seçilen 6 adeti I.grubu oluþturdu. II.Grup : Gebeliklerinin 12. gününde (GD 12) gavajla 60 mg/kg dozda atRA (15) verilen sýçanlara (n=3) gebeliklerinin 18. gününde servikal dislokasyon uygulanýp, midsaggital insizyonla fetusleri alýndý. Bu fetuslerden özellikle geliþim geriliði olanlar seçilip (n= 6) II.grup oluþturuldu. III. Grup: Gebeliklerinin 8. gününde (GD 8) gavajla 60 mg/kg dozda atRA (15) verilen sýçanlara (n=3) 281 Prenatal Dönemde Endokondral Kemýkleþme Üzerýne Retýnoýk Asýdýn Etkýlerý gebeliklerinin 18. gününde servikal dislokasyon uygulanýp, midsaggital insizyonla fetusleri alýndý. Bu fetuslerden özellikle geliþim geriliði olanlar seçilip (n= 6) III.grup oluþturuldu. Fetuslar Bouin tespit solüsyonuna atýldý, anomaliler açýsýndan incelenip, radyografileri çekildikten sonra midsaggital olarak diseke edildi. Bouin solüsyonunda 24 saatlik tespitten sonra dereceli alkollerle (50, 60, 70, 80, 90, 96, 100º ) yýkandý. Xylol serilerinden geçirildi. Isýsý 54ºC olan etüvde xylol-parafin, yumuþak parafin ve sert parafin ile muamele edilip bloklar hazýrlandý. Parafin bloklardan 5 µmlik kesitler alýnýp Hematoksilen Eozin tekniði ile boyandý. Kesitler BH2 Olympus fotomikroskopla incelenip fotoðraflandý. Bulgular Kontrol grubuna ait kesitlerde endokondral kemikleþme belirgin olarak izlendi. Bu grup vertebralarda hipertrofik kýkýrdak zonu, kemikleþen alanlar ve yüksek osteoblastik aktivite saptandý (Resim 1). Nörulasyon sonrasý (GD12) atRAe maruz kalan fetuslarýn (grup II) vertebralarýnda kontrol grubu ile benzer þekilde hipertrofik kýkýrdak zonu, kemikleþmenin oluþtuðu alanlar ve osteoblastik aktivite gözlenmekle birlikte, vertebralar kontrolden daha küçük çaplý olarak ayýrt edildi (Resim 2). Nörulasyon öncesi (GD8) atRAe maruz kalan fetuslarda (grup III) vertebra çaplarýnýn kontrole ve grup IIye göre oldukça küçük olduðu ve herhangi bir kemikleþme belirtisine sahip olmadýklarý tespit edildi. Bu grup fetuslarda perivertebral bölgelerde belirgin vaskülarizasyon gözlendi ve vertebralarýn henüz kýkýrdak yapýlarýný koruduðu saptandý (Resim 3). Yapýlan radyografik çalýþmalar da ýþýk mikroskobik bulgularý desteklemekte idi. Kontrol grubuna ait radyografide kemik yapýlarý ossifiye idi; vertebra, kafatasý, ekstremite ve yüz kemikleri belirgin olarak ayýrt edildi (Resim 4a). II. Grup deneklerdeki ossifikasyonun kontrol grubundaki kadar geniþ çaplý ve belirgin olmadýðý gözlendi. Vertebralar kýsmen ossifiye idi (Resim 4b). III. Grup deneklerdeki kemiklerin ossifikasyonu belirgin olmayýp kýkýrdaðýmsý olarak gözlendi. Kafatasý, yüz kemikleri ve ekstremite kemiklerinin geliþimi yetersiz ve küçük boyutlu olarak ayýrt edildi (Resim 4c). Grup II ve III teki fetuslarýn tepe-oturma nokta uzunluklarý kontrol grubuna göre daha kýsa olarak tespit edildi. 282 Resim 1. Grup I. Hipertrofik kýkýrdak zonu (h), osteoblastik aktivite (oklar), kemikleþen alanlar (*) belirgin olarak gözlenmekte. Hematoksilen Eozin x 120 Resim 2. Grup II. Hipertrofik kýkýrdak zonu (h), osteoblastik aktivite (ok) ve kemikleþen alanlar (*). Vertebra çapýnýn Grup Iden daha küçük olduðu belirgin. Hematoksilen Eozin x 120 Resim 3. Grup III. Vertebra çapýnýn Grup I ve IIye göre anlamlý derecede küçük olduðu, ve rtebranýn kýkýrdak yapýsýnda olduðu (*) ve perivertebral bölgenin oldukça vaskülarize olduðu ayýrt edilmekte. Hematoksilen Eozin x 120 Erciyes Týp Dergisi (Erciyes Medical Journal) 2007;29(4):280-284 Neriman Çolakoðlu, Ayþe Murat Aydýn, Hatice Banu Özel, Enver Ozan, Aysel Kükner Þekil 4: Fetuslerin lateral radyografileri. a: Grup I . Kemik yapýlar belirgin þekilde ossifiye izlenmektedir. Vertebralar (kalýn ok), kafatasý ( ince ok ) ve yüz kemikleri (ok baþý) net izlenmektedir. b: Grup II. Vertebralar kýsmen ossifiye izlenmektedir (kalýn ok).c:Grup III. Genel olarak kemiklerin ossifikasyonu yetersizdir (kalýn ok). Kafatasý ve yüz kemiklerinin geliþimi yetersizdir ve bu kemikler küçük boyutlardadýr. Ekstremiteler belirgin derecede kýsa ve ince olarak gözlenmektedir (ince ok). b ve c deki fetuslerin boyutlarýl a ile karþýlaþtýrýldýðýnda küçüktür. Tartýþma Fizyolojik koþullarda retinoik asit kondrojenik farklýlaþma ve mineralizasyonu aktive eden A vitamini metabolitlerindendir (16,17). Memeli ekstremite geliþiminde RA kondrojenik hücreleri de kapsayan birçok hücre türünün farklýlaþmasýný etkilemektedir (13). Birçok deneysel çalýþma endojen retinoidlerin ve A vitamini metabolitlerinin vertebra ve ekstremite geliþiminde önemli rol oynadýðýný göstermiþtir (18). Teratolojik çalýþmalar retinoidlerin gerek fazlalýðýnýn gerekse yetersizliðinin ekstremite geliþiminde bozukluða yol açtýðýný ortaya koymuþtur ( 18-20). Yu ve Xing RAin iskelet geliþiminin erken safhalarýnda (kondrogenezis) etkili olduðunu bildirmektedirler. Yaptýklarý çalýþmada RAin kýkýrdak farklýlaþmasýný inhibe ederek iskelet malformasyonlarýna yol açtýðýný tespit etmiþlerdir (21). Biz de yaptýðýmýz çalýþmada kýkýrdak taslaðýn yerini kemik dokuya býrakmamasýný kondrogenezis aþamasýndaki bir inhibisyondan kaynaklandýðýný düþünmekteyiz.Yapýlan iki farklý çalýþmada atRAin embriyonik mezenþimal hücrelerin kondrojenik farklýlaþmasýný inhibe ettiði, farklýlaþan kondrositlerde ise fenotipik kaybýn meydana geldiði saptanmýþtýr (22, 23). Yapýlan bu çalýþmada da morfolojik ve radyolojik incelemeler atRA fazlalýðýnýn ekstremite ve fetal tepe oturma noktasý uzunluðunda önemli derecede kýsalýða yol açtýðýný gösterdi. Yine fetal vertebralardan alýnan kesitlerde geliþimin erken döneminde atRA uygulanan deneklerde osteogenezisin geciktiði gözlendi. Radyografik incelemelerimizde bu bulgumuzu destekler nitelikte olup bu grup vertebralarýn kemikten daha çok kýkýrdaðýmsý bir taslaktan ibaret olduðunu gösteriyordu. Bu çalýþmanýn sonucunda prenatal dönemde teratojenik dozda maternal atRAe maruz kalan fetuslerde vertebra ve ekstremite geliþiminde bozukluk ve ossifikasyonda gecikme saptanmýþtýr. Bu durum özellikle nörülasyon öncesinde atRAe maruz kalan fetuslarda daha belirgin olarak gözlendi. Ýskelet geliþiminde ve kemikleþmede birçok sinyal molekülünün birbiriyle etkileþtiði ve koordineli hareket ettiði bilinmektedir. Biz yüksek doz atRAin sinyal molekülleri arasýndaki etkileþimi bozup hücresel proliferasyonu ve farklýlaþmayý inhibe ederek ekstremite ve vertebralarda geliþim bozukluklarýna yol açtýðýný düþünmekteyiz. Erciyes Týp Dergisi (Erciyes Medical Journal) 2007;29(4):280-284 283 Prenatal Dönemde Endokondral Kemýkleþme Üzerýne Retýnoýk Asýdýn Etkýlerý Kaynaklar 1.Young B, Heath JW, eds. Wheaters Functional Histology. Sydney: Churchill Livingstone; 2000. 2. Garimella R, Bi X, Cmacho N, Sipe JB, Anderson HC. Primary culture of rat growth plate chondrocytes: an in vitro model of growth plate histotype, matrix vesicle biogenesis and mineralization. Bone 2004; 34: 961-970. signaling and skeletal development. Novartis Found Symp. 2001; 232: 171-185 14.Colakoglu N, Kukner A. Teratogenicity of retinoic acid and its effects on TGF-â2 expression in the developing cerebral cortex of the rat. J Mol Histol 2004; 35: 823827 3. Kirsch T, von der Mark K. Remodelling of collagen types I, II and X and calcification of human fetal cartilage. Bone Miner 1992; 18: 107-117. 15.Yasuda Y, Konishi H, Kihara T, Tanimura T. Developmental anomalies induced by all-trans retinoic acid in fetal mice: II. Induction of abnormal neuroepithelium. Teratology 1987; 35: 355-366 4. Kirsch T, Nah HD, Shapiro IM, Pacifici M. Regulated production of mineralizastion competent matrix vesicles in hypertrophic condrocytes. J Cell Biol 1997; 137: 11491160. 16.Koyama E, Golden EB, Kirsch T, et al. Retinoid signaling is required chondrocytes maturation and endochondral bone formation during limb skelotogenesis. Dev Biol 1999; 208: 375-391 5. Kirsch T, Harrison G, Golub EE, Nah HD. The roles of annexins and types II and X collagen in matrix vesicles mediated mineralization of growth plate cartilage. J Biol Chem 2000; 275: 35577- 35583. 17.Wu LN, Ishikawa Y, Nie D, Genge BR, Wuthier RE. Retinoic acid stimulates matrix calcification and initiates type I collagen synthesis in primary cultures of avian weigth-bearing growth plate chondrocytes. J Cell Biochem 1997; 65: 209-230. 6. Leboy PS, Shapiro IM, Uschmann BD, Oshima O, Lin D. Gene expression in mineralizing chick epiphyseal cartilage. J Biol Chem 1988; 263: 8515-8520. 18.Means AL, Gudas LJ. The roles of retinoids in vertebrate development. Annu Rev Biochem 1995; 64: 201-233 7. Schmid TM, Bonen DK, Luchene L, Linsenmayer TF. Late event in chondrocytes differentiation: hypertrophy, type X collagen synthesis and matrix calcification. In vivo 1991; 5: 533-540. 19.Lee GS, Kochhar DM, Collins MD. Retinoid-induced limb malformations. Curr Pharm Des 2004; 10 (22) : 2657-2699. 8. Cancedda FD, Gentili C, Manduca P, Cancedda R. Hypertrophic chondrocytes undergo further differentiation in culture.J Cell Biol 1992; 117: 427- 435 20.Zhou J, Kochhar DM. Cellular anomalies underlying retinoid-induced phocomelia. Reprod Toxicol 2004; 19: 103-110 9. Raouf A, Seth A. Ets transcription factors and targets in osteogenesis. Oncogene, 2000; 19:6455-6463. 21.Yu Z, Xing Y. All-trans retinoic acid inhibited chondrogenesis of Mouse embryonic palate mesenchymal cells by down-regulation of TGF-â/Smad signaling. Biochem Biophys Res Commun 2006 ; 340: 929-934. 10. Noy N. Retinoid binding proteins: Mediators of retinoid action. Biochem J 2000; 348: 481-495 11. Pauken CM, LaBorde JB, Bolon B. Retinoic acid acts during periimplantational development to alter axial and brain formation. Anat Embryol 1999; 200: 645-655 12. Nau H. Retinoid teratogenesis: Toxicokinetics and structure-specificity. Arc Toxicol 1993; 16: 118-127. 13. Underhill TM, Sampaio AV, Weston AD. Retinoid 284 22. Cho SH, Oh CD, Kim JS, Kim IC, Chun JS. Retinoic acid inhibits chondrogenesis of mesenchymal cell by sustaining expression of N-cadherin and its associated proteins. J Cell Biochem 2003; 89: 837-847 23. Bhasin N, Kernick E, Luo X, Seidel HE, Weiss ER, Lauder JM. Differential regulation of chondrogenic differentiation by the serotonin 2B receptor and retinoic acid in the embryonic mouse hindlimb. Dev Dyn 2004 ; 230: 201-209. Erciyes Týp Dergisi (Erciyes Medical Journal) 2007;29(4):280-284