S8. Silimarin Meme Kanseri Hücrelerinde (MCF-7)
Transkript
S8. Silimarin Meme Kanseri Hücrelerinde (MCF-7)
Silimarin Meme Kanseri Hücrelerinde (MCF-7) Doksorubisinin Etkisini Arttırır Mı? Nil Bahar Atasoy, Elif Bengisu Bilgin, Ahmet Ozan Kaleci, Mete, Cansu Ünsal, Alperen Kutay Yıldırım Danışman: Doç. Dr. Erkan Yurtcu Çınar AMAÇ: Doksorubisin birçok neoplazmda kullanılan antrasiklin grubu bir kemoterapötiktir. Ancak sınırlı sayıda hastanın fayda görmesi doksorubisin içeren kombinasyon kemoterapi rejimleri arayışlarına yol açmıştır. Binlerce yıldır hepatoprotektif etkisi bilinen Silimarin, deve dikeni (Silybum marianum) özütünden elde edilen bir flavolignindir. Antikarsinojenik ve antioksidan etkilerinin olması sebebiyle kemoterapi alan hastalarda en sık kullanılan ajanlar arasındadır. Silimarin, Avrupa ve Asya’da LegalonTM ve Silipide IdB1016 adı altında klinik olarak da kullanılmaktadır. Bu çalışmada silimarinin meme kanseri hücreleri üzerinde doksorubisinin etkinliğini arttırıp arttırmadığının belirlenmesi amaçlanmıştır. YÖNTEM: MCF-7 hücreleri standart koşullar altında kültüre edildi. Hücrelerin canlılıkları Tripan Mavisi atma, protein düzeyleri Bradford, uygulanacak doksorubisin dozu XTT yöntemiyle değerlendirildi. Silimarin dozu, oral yolla kullanıldığı zaman ulaştığı en yüksek plazma konsantrasyon değeri (300 ng/ml) olacak şekilde belirlendi. Hücrelere doksorubisin ve silimarin tek tek ve birlikte olacak şekilde 24 ve 48 saat süreyle uygulandı. Genotoksik hasar tek hücre jel elektroforez (Comet Yöntemi) ile belirlendi. SONUÇ: 24 ve 48 saat uygulama ile DNA hasarını anlamlı derecede artıran doksorubusinin silimarin ile kombine edildiğinde bu hasar tek başına uygulandığından daha yüksek değerlere ulaştı (p<0.05). Silimarin tek başına uygulandığında 24 saatte hasar oluştururken (p<0.05) 48 saatte oluşturmadı (p>0.05). İn vitro koşullarda silimarinin konvansiyonel kemoterapötiklerle kombine edildiğinde bu ajanların etkinliğini artırdığının gösterilmesi kombinasyon kemoterapileri için iyi bir aday olduğunu düşündürmektedir. Silimarinin etkinliğini değerlendirecek daha detaylı araştırmalara ihtiyaç vardır. Anahtar Kelimeler: Genotoksisite Doksorubisin, Silimarin, Meme Kanseri, GİRİŞ Meme kanseri, dünyada tüm kanser türleri arasında %25 oranla ikinci sırada yer almaktadır, Türkiye’de ise kadınlar arasında %45,1’lik oranla ilk sırada yer almaktadır (1,2). Hastalığın tedavisinde cerrahi, radyasyon tedavisi, endokrin tedavi ve/veya kemoterapi uygulanmaktadır. Kemoterapide sıklıkla doksorubisin, siklofosfamid, metotreksat ve florourasil gibi ilaçlar kullanılmaktadır. İçerisinde doksorubisinin de bulunduğu antrasiklinler, oksijen serbest radikalleri, hidroksil radikalleri ve hidrojen peroksit radikalleri içeren reaktif oksijen molekülleri oluşturarak DNA, mRNA, protein ve lipid hasarı yapar. Oluşan lipid peroksidasyonu bu ilaç grubunun kalp kası toksisitesi için karakteristiktir (Öktem 2005). Doksorubisin S. Peucetius’tan mutajenik uygulamayla elde edilen Streptomyces peucetius var. Caesius bakterisinden elde edilen antrasiklin grubu bir antibiyotiktir (Malla 2010). En büyük sitotoksik etkisini topoizomeraz II aktivitesini olumsuz etkileyerek gösterir. Ayrıca DNA’da baz çiftlerinin arasına girerek DNA replikasyonunun ve transkripsiyonun bozulmasına neden olurlar. Sonuçta DNA onarım sistemi bozulur ve DNA kırıkları oluşur. Bu durumda hücre döngüsü durdurularak hücre apoptozise yönlendirilir. Ancak çeşitli meme kanseri olgularında doksorubisin gibi anti-kanser ajanlara direnç geliştiği bilinmektedir (Ergin 2011). Doksorubisin, suda çözünebilmesine rağmen nonpolar organik çözücülerde çözünmemektedir. Klinikte, meme, yumurtalık, mesane, akciğer, tiroid, mide kanserleri ve nöroblastoma, yumuşak doku sarkoması, multiple myeloma, Hodgkin's lenfoma gibi hastalıkların tedavisinde de yaygın bir kemoterapötik olarak kullanılan doksorubisinin bu özelliği, tercih edilmesini sağlamıştır (Arcamone 2000, Malla 2010). Doksorubisin gibi sistemik toksisite yaratabilen ilaçların normal dokulara zarar vermeden kanserli dokuya etki edecek dozda uygulanamadığı belirtilmiştir. Bu nedenle normal dokulara zarar vermeden ilacın etkili olmasını sağlayacak kombinasyon terapileri kullanılması uygun görülmüştür (Rastegar 2013, Ramakrishnan 2009). Flavanoidler, meyvelerde, bitkilerde ve diğer bitkisel ürünlerde bulunan anti-oksidan aktiviteye sahip bileşiklerdir. Bugüne kadar 4000’den fazla flavanoid tanımlanmıştır (Liu 2004). Normal hücrelerde flavonoidler genellikle anti-oksidan karakter göstermelerine rağmen kanser hücrelerindeki redoks dengesizliği sebebiyle pro-oksidan özellikleri ortaya çıkmaktadır. Pro-oksidanlar başta DNA olmak üzere plazma zarını da içeren diğer hücresel zarlarda ve yapılarda hasara yol açmaktadır (Schwartz 1996). Silimarin deve dikeni (silybum marianum) bitkisinden elde edilen ve silychristin, isosilychristin, silydianin, silybin A ve B, isosilybin A ve B içeren bir flavonoiddir (Abouzid 2012, Hadaruga 2009). İyi tolere edilebilen, düşük toksisite ve oldukça az yan etkilere sahip olan silimarin 2000 yıldan beri hepatit ve siroz tedavisi başta olmak üzere ve karaciğeri toksik ajanlardan koruma amacıyla kullanılmaktadır (Kalla 2014, Zhu 2001, Zi 1998, Hadaruga 2009). Silimarinin in vivo ve in vitro koşullarda antioksidatif, antilipid peroksidatif, antikanser, antifibrotik, antiinflamatuar ve immünomodülatör özelliklere sahip olduğu görülmüştür (Kalla 2014, Zi 1998). Silimarin antikarsinojenik etkileri sebebiyle kemoterapi alan hastalar arasında tamamlayıcı ve alternatif tedavi amacıyla en sık kullanılan ajandır (Ramasamy 2008). Son 30 yıldır silimarinin ticari formları (Legalon™ ve Silipide IdB1016) Avrupa ve Asya’da klinik olarak da kullanılmaktadır (Huber 2008). Tek hücre jel elektroforezi (Comet Assay) tekniği hücre düzeyinde DNA hasarını saptamak ve miktarını belirlemek için uygulanan non-invaziv, hızlı ve hassas bir floresan mikroskobik yöntemdir. Yaşlanma, moleküler epidemiyoloji, klinik ve genetik toksikoloji alanlarında önemli uygulamaları olan ‘‘Comet Assay’’ son yıllarda giderek artan bir sıklıkta apoptozis, oksidatif stres, antioksidan çalışmalarında da yer almıştır (Dinçer 2010). Bu çalışmada silimarinin meme kanseri hücreleri üzerinde doksorubisinin etkinliğini arttırıp arttırmadığının belirlenmesi amaçlanmıştır. GEREÇ VE YÖNTEM Bu çalışmada MCF-7 (ATCC), insan meme kanseri hücreleri kullanıldı. Hücreler standart kültür koşularında ve %10 FBS içeren RPMI 1640 besiyeri içerisinde 370C sıcaklıkta ve %5 CO2 içeren inkübatörde (Heraeus, Hanau, Almanya) inkübe edildi. Doksorubusin ve Silimarin MCF7 ve silimarin hücrelere tek tek ve birlikte olacak şekilde 24 ve 48 saatlik sürelerle uygulandı. Hücre canlılığı tryphan blue atma tesit ile değerlendirildi. %95 ve üzerinde canlılık gösteren kültürler çalışmaya dahil edildi. Hücre proliferasyonu Doksorubisinin MCF-7 hücrelerinin proliferasyonu üzerine etkileri kolorimetrik olarak 3-(4,5-dimethyl-2-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H tetrazolium bromidin (XTT-Sigma-Aldrich) biyokimyasal indirgenmesi ilem değerlendrildi. Canlı hücrelerin mitokondrial aktivitesi sonucu oluşan formazan kristallerinin 540 nm'de spektrofotometrik olarak ölçüldü (Biotek Instrument ELx800, Winooski, Vermont, ABD). Hücre inhibisyonu, IC50 dozları ve IC50 dozunun yarı konsantrasyonu (metnin geri kalanında yarı doz olarak ifade edilecektir) proliferasyon grafiklerinin logaritmik eğrileriyle hesaplandı. Comet Assay (Alkali Tek Hücre Jel Elektroforezi) Genotoksik hasarın belirlenmesi amacıyla uygulanan yöntem kısaca şu basanakları içermektedir. Tüm uygulama yapılan hücreler %0.5’lik düşük erime sıcaklığına sahip agaroz (LMPA; Sigma-Aldrich) ile karıştırıldıktan sonra 1%‘lik (w/v) normal erime sıcaklığına sahip agarozla (NMPA; SigmaAldrich) kaplı lamlara yayıldı. Lamlar lizis solüsyonu içinde karanlıkta 4oC sıcaklıkta 2 saat boyunca inkübe edildikten sonra yüksek pH dereceli ortamda elektroforeze tabi tutuldu. Elektroforez sonrası Etidium bromür (EtBr) ile boynanarak flouresans mikroskopta değerlendirildi. (Yurtcu 2012). Tüm uygulamalar en az üçer defa tekrar edilerek her grup için her uygulama grubunda en az 100 hücre sayıldı. Hücrelerin nükleusları kuyruk ve baş oranlarına göre gözlemciler tarafından 0, +1, +2, +3, +4 olmak üzere değerlendirildi (Resim 1) (İşeri 2013). Resim1: Comet skorları Oluşan DNA Hasarlarına Göre Comet Skorları 0 +1 +3 +2 +4 İstatistiksel Analiz 24. ve 48. saatler arası bağımlı iki grup ortalamalarının karşılaştırmaları için parametrik test varsayımları sağlandığından karşılaştırmalar Eşleştirilmiş t-testi ile yapılmıştır. Ancak 24. saatin ve 48. saatin kendi içlerindeki bağımlı 6 grup bakımından küresellik varsayımı sağlanmadığından parametrik olmayan istatistik analiz yöntemlerinden Friedman testi ile ve ardından Bonferroni-Dunn çoklu karşılaştırma yöntemi ile grup ortancaları karşılaştırılmıştır. p<0,05 düzeyi istatistiksel olarak anlamlı kabul edilmiştir. Veri analizi SPSS 17.0 (SPSS Ver.17.0, Chicago IL, USA). BULGULAR Doksorubusinin IC50 dozu 24 saat ve 48 saat uygulama sonrasında MTT yöntemi ile belirlenen doksorubusin dozları sırasıyla 70 µM ve 40 µm olarak belirlendi (Resim 2) Resim 2: Doksrubisine ait IC50 konsantrasyonu DNA hasarı 24 saatlik uygulama sonucunda; Doksorubisin IC50 konsantrasyonunda uygulamasına bağlı olarak ortaya çıkan DNA hasarı kontrol grubuna göre anlamlı derecede yüksekti (p<0.05). Doksorubisin IC50 dozunun 24 saat uygulanmasıyla gözlenen DNA hasarı aynı zamanda silimarinin tek başına kullanıldığı grup, Doksorubisinin yarı dozunun uygulandığı grup ve doksorubisinin yarı dozunun silimarin ile kombine edilerek uygulandığı gruptan daha yüksekti. Doksorubisinin yarı dozunun kullanıldığı grupta elde edilen DNA hasarı kontrol grubundan anlamlı olarak farklı değildi. Doksorubisinin yarı dozunun silimarin ile kombine edilerek uygulandığı gruptan elde edilen DNA hasar değeri doksorubisinin IC50 dozunu içeren gruplardan ve silimarinin tek başına uygulandığı gruptan daha azdı ancak bu grubun doksorubisinin yarı dozunun tek başına uygulandığı gruptan daha fazla DNA hasarı oluşturduğu belirlendi. Silimarinin tek başına uygulandığı grupta gözlenen DNA hasarı doksorubisinin yarı dozunun uygulanmış olduğu gruptan daha yüksekti. Doksorubisinin IC50 dozuyla birlikte silimarinin uygulandığı grupta 24 saatlik uygulama sonrasında en yüksek düzeyde DNA hasarı gözlendi (Tablo 1). 48 saatlik uygulama sonucunda silimarinin tek başına kullanıldığı grup hariç bütün gruplarla kontrol grubunun arasında anlamlı bir fark gözlemlenmedi (p<0,05). Silimarinin tek başına kullanıldığı grup bütün gruplardan daha düşük DNA hasarına yol açtı. Doksorubisinin yarı dozunun kullanıldığı grup, doksorubisinin yarı dozuyla birlikte silimarin kullanılan grup ve doksorubisinin IC50 dozunun uygulandığı grup birbirleriyle istatistiksel olarak anlamlı fark oluşturmadı (p>0,05). Doksorubisinin IC50 dozu ile silimarinin beraber kullanıldığı grup en yüksek DNA hasarına yol açan grup olarak belirlendi (Tablo2 ve 3). 24 SAAT Kontrol Kontrol Silimarin p<0.05 Silimarin Dox IC50 Dox IC50+ Silimarin Dox IC50/2 Dox IC50/2+ Silimarin p<0.05 p<0.05 p>0.05 p<0.05 p<0.05 p<0.05 p<0.05 p<0.05 p<0.05 p<0.05 p<0.05 p<0.05 p<0.05 Dox IC50 Dox IC50+Silimarin Dox IC50/2 p<0.05 Comet Standart Skoru Sapma 25,33 (± 3,78) 94 (± 8,54) 119 (± 26,51) 140 (± 13,74) 36,33 (± 14,5) 81,66 (± 8,73) Dox IC50/2+Silimarin Tablo1: 24 saat uygulama sonrası elde edilen Comet Skorları Dox IC50/2 Dox IC50/2 + Silimarin p<0.05 p<0.05 p<0.05 p<0.05 Silimarin p<0.05 p<0.05 p<0.05 p<0.05 43,33 (± 20,84) Dox IC50 p<0.05 p>0.05 p>0.05 135,33 (± 16,86) p<0.05 p<0.05 168,66 (± 5,5) p>0.05 108,33 (± 30,66) 48 SAAT Kontrol Dox IC50+Silimarin Dox IC50/2 Dox IC50/2+Silimarin Kontrol Silimarin p>0.05 Dox IC50 Dox IC50+ Silimarin Comet Standart Skoru Sapma 21 (± 5) 111,33 (± 25,02) Tablo2: 24 saat uygulama sonrası elde edilen Comet Skorları Uygulama/Süre 24 h 48 h 25,33 21 Silimarin 94* 43,33 Doksorubisin IC50 119 135,33 Doksorubisin IC50+Silimarin 140 168,66 Doksorubisin IC50/2 36,33 108,33 Dox IC50/2+Silimarin 81,66* 111,33 Kontrol *p<0.05 Tablo 3: 24 ve 48 uygulamalar sonrası elde edilen Comet skorları TARTIŞMA Doksorubisin kemoterapi protokollerinde oldukça sık yer almakla birlikte tek başına yüksek dozda ya da uzun sürelerle kullanılması sistemik birikime yol açarak kardiyomiyopati, hipotansiyon, taşikardi, kardiyak dilatasyon, ventriküler yetmezlik gibi olumsuz yan etkiler oluşturur. Bu olumsuz yan etkilerini engellemek amacıyla çeşitli kombinasyon kemoterapi rejimleri arayışları ortaya çıkmıştır (Jose 2002). Kombinasyon terapilerinde kullanmak amacıyla bitkisel kaynaklı kimyasal bileşikler araştırmaların konusu olmuştur (Riddick 2005, Jin 2010 ve Rastegar 2013). Danz ve arkadaşları kırmızı şarapta bulunan bir stilbene olan resveratrolün neonatal rat ventrikül miyositlerinde doksorubisin kullanımına bağlı olarak ortaya çıkan kardiyomiyosit ölümünü inhibe ettiğini göstermişlerdir (Danz 2009). Silimarin deve dikeni bitkisinden elde edilen bir flavolignan olup en büyük biyoaktif bileşeni silibinindir. Binlerce yıldır hepatit ve siroz tedavisi başta olmak üzere alkol ve mantar gibi karaciğer hasarı oluşturan kimyasallara karşı hepatoprotektif ajan olarak kullanılmaktadır (Lee, 2011). Silimarinin normal hücreleri oksidatif hasara karşı koruyucu etkisinin olması ötesinde (Yurtcu, 2012) oral yolla alındığı zaman eriştiği en yüksek plazma konsantrasyonunda (300 ng/ml) doksorubisinin hepatosellüler karsinoma hücreleri üzerinde sitotoksik ve genotoksik etkilerini artırdığı in vitro olarak gösterilmiştir (Yurtcu, 2014). Daha önceki raporlarda çoğunluğu meme kanseri hücreleri olmak üzere kolon ve prostat kanseri gibi bazı hücre dizilerinde silimarin ve aktif bileşeni silibininin doksorubisin ile sinerjestik etkili olduğu gösterilmiştir (Rastegar 2013, Sadava 2013, Colombo 2011, ve Tyagi 2002 ve 2004). Ayrıca buna benzer etkilerin naringenin, quercetin ve resveratrol gibi diğer bitkisel kaynaklı kimyasallarla da elde edildiği çeşitli çalışmalarla gösterilmiştir (Zhang 2009, Václavíková 2008 ve Kim 2013). Ancak Rifki ve arkadaşlarının yaptığı başka bir çalışmada güçlü bir flavonoid olan hesperidinin doksorubisin ile birlikte kombine edildiğinde her iki ajanın tek baçlarına gösterdikleri apoptotik etkiyi gösöstermediği belirtilmiştir (Rifki 2014). Bu çalışmada silimarinin, doksorubisinin MCF-7 hücreleri üzerinde genotoksik etkilerini arttırıp arttırmadığı değerlendirilmiştir. Bu amaçla doksorubisin ve silimarin MCF7 meme kanseri hücrelerine hem tek başlarına hem de birlikte 24 ve 48 saat sürelerle uygulanmıştır. Gerek 24 gerekse 48 saat uygulama sonrasında oluşan DNA hasarı değerlendirildiğinde, doksorubisinin uygulama yapılmamış kontrol grubu hücrelere göre genotoksik hasarı istatiksel açıdan anlamlı olarak artırdığı belirlenmiştir (Tablo 2,3). Doksorubisinin her iki uygulama süresinde görülen bu etkisi silimarin ile birlikte uygulandığında istatiksel açıdan anlamlı olacak şekilde daha da artmıştır. Rastegar ve arkadaşları MCF7 hücrelerinde doksorubisinin silimarin ile birlikte uygulandığında canlılığı yalnız başına uygulandığından daha fazla düşürdüğünü göstermişlerdir. Ancak bu çalışmada hücrelere uygulanan doksorubisin dozları bizim XTT ile belirlediğimiz dozun altında, silimarin dozu ise ulaşılabilir plazma düzeyinin oldukça üzerindedir (Rastegar 2013). Tyagi ve arkadaşları silimarinin aktif bileşeni olan silibininin çeşitli kemoterapötiklerle olan ilişkisini MCF7 meme kanseri hücreleri üzerinde değerlendirmişlerdir. Bu çalışmanın sonuçlarına göre silibinin en yüksek sinerjik etkiyi doksorubisin ile göstermektedir ve birlikte uygulanmaları ajanların tek başlarına uygulandıkları zaman gösterdikleri apototik etkiden daha yüksek bir etki göstermektedir (Tyagi 2004). Ramakrishnan ve arkadaşlarının yaptığı bir çalışmada 24 saat silimarin uygulanmış HepG2 hücrelerinde hücre proliferasyonunun ve hücre döngüsünün inhibe edildiği, hücrelerin apoptoza yönlendirildiği görülmüştür (Ramakrishnan 2009). Bizim sonuçlarımız da bu çalışmaların sonuçlarını destekler nitelikte olup iki ajanın bir arada kullanılması tek başlarına kullanıldıklarından daha yüksek genotoksik hasar oluşturmuştur. Zhang ve arkadaşları doksorubisinin çeşitli flavonoidlerle kombinasyonu sonrasında ortaya çıkan sitotoksisiteyi inceledikleri çalışmada silimarinin bu etkinliği artırdığını göstermişlerdir. Silimarinin bu etkisinin altında yatan mekanizma Pgp proteini ile olan etkileşimidir. Silimarin MCF7 meme kanseri hücrelerinde ATPaz bağımlı bu hücresel pompaya bağlanarak onu inhibe etmekte böylece sitoplazmadan dışarı madde atımını engellemektedir. Böylece sitotoksik ajanın sitoplazmada birkimini sağlayarak daha etkin bir sonuç alınmasına yol açmaktadır (Zhang 2003). Çalışmamızda değerlendirmeye çalıştığımız bir diğer nokta doksorubisinin doz bağımlı etkinliğidir. Bu amaçla hücrelere XTT yöntemi ile belirlediğimiz IC50 dozunun yarı konsantrasyonunu da uyguladık. Sonuçlarımıza göre yarı doz doksorubisin 24 saat uygulama sonrasında kontrol grubuna göre genotoksik hasarı anlamlı derecede artırmazken, uygulama süresi 48 saate çıkarıldığında anlamlı derecede artış sağlamaktaydı (Tablo 2, 3). Uygulama süreleri ve gruplar kendi içinde değerlendirildiğinde; 24 saat uygulama sonrasında yarı doz doksorubisin uygulamasına bağlı artışın tam doz uygulamasından anlamlı derecede düşük olduğu gözlendi. Elde ettiğimiz bu sonuç Öktem ve arkadaşlarının spheroid hücre kültürleri üzerine yaptıkları bir başka çalışmada da buldukları doksorubisinin artan dozlarıyla orantılı olarak ortaya çıkan sitotoksisitenin arttığı sonucunu destekler niteliktedir (Öktem 2005). İlginç bir nokta olarak yarı doz doksorubisin silimarin ile kombine edildiğinde ortaya çıkan değer kontrol grubundan anlamlı derecede yüksekti. Bu sonuç silimarinin diğer kemoterapötiklerle birlikte uygulandığında daha kısa sürede ve daha az konsantrasyonda etki ortaya çıkmasını sağladığını göstermiştir. Abncak uygulama süresi uzatıldığında (48 saat) silimarinin bu katkısı ortadan kalkmaktadır. Bu çalışmada ayrıca doksorubisin etkinliği süre bağımlı olarak da değerlendirilmiştir. Ancak doksorubisinin tek başına ve kombine uygulandığı hiçbir grupta zaman artışına bağlı olarak ortaya çıkan genotoksik hasarlarda anlamlı bir fark belirlenememiştir. Bu yüzden doksorubisine bağlı hasarın sadece doz bağımlı olduğunu düşünüyoruz. AlGhamdi doksorubisinin etkinliğini göstermesi için en az 24 saate ihtiyaç olduğu ve hücrelerin %50 sini öldürmesi için gereken zamanın 40 saat olduğu belirtilmiştir. (Al-Ghamdi 2008). Çalışmamızda ayrıca silimarin hücrelere yalnız başına da uygulanarak ortaya çıkan genotoksik hasar değerlendirilmiştir. 24 saat uygulama sonrasında silimarin uygulamasına bağlı oluşan genotoksik hasar kontrol grubuna göre ve yarı doz doksorubisin uygulmasına göre anlamlı derecede yüksekti. Agarwal ve arkadaşları da yaptıkları bir çalışmada silimarinin A431 epidermoid karsinom hücrelerinde büyümeyi güçlü bir şekilde inhibe ettiği ve apoptoza yönelime neden olduğu gözlemlemişlerdir (Agarwal 2002). Ancak uygulama süresi 48 saate çıkarıldığında oluşan hasar kontrol grubunda belirlediğimiz hasara göre yüksek değildi. Bulduğumuz bu sonuç Yurtcu ve arkadaşlarının yaptıkları bir çalışmada 48 saatlik uygulamada silimarinin HepG2 hücreleri üzerinde etkinliğinin 24 saatlik uygulamaya göre azaldığı yönündeki sonuçlarını destekler niteliktedir (Yurtcu 2014). Silimarinin bioactive komponenti olan silibinin metal iyonları varlığında prooxidant etki gösterir (Riddick 2005 ve Vacek, 2014). Prooksidant çevre bu iyonların etkisi ile superoksit anyonu (O2·-) ve hidrojen peroksitten (H2O2) hydroksil radikalleri (HO·) oluşumunu hızlandırır. Lipid peroksidasyonu gibi olayların başlaması ise serbest radikal yürütülü hasarın ilk basamaklarından birisidir. Sonuçta DNA, lipid ve proteinler kovalent olarak modifiye olur (Riddick 2005 ve Fritz, 2011). Kanser hücrelerindeki bozuk redoks potansiyeli ve antioksidan enzim savunma system kusurları bu hücreleri prooksidan hasarına duyarlı hale getirmesinin bulduğumuz sonuçları açıklar nitelikte olduğunu düşünüyoruz. Çalışmamızın sonuçlarını toplu olarak değerlendirdiğimizde i) silimarin doksorubusinin genotoksik hasar oluşturma potansiyelini artırdığını ii) silimarin kullanılan doksorubisin dozu azaltıldığında halde bile doksorubisinin etkinliği artırdığını iii) silimarin tek başına uygulandığında süre bağımlı olarak genotoksik hasar oluşturduğunu belirledik. Tüm bu noktalar göz önüne alındığında normal hücrelerde kemoterapötiklerin oluşturduğu toksik hasarı azaltan, kanser hücrelerinde seçici olarak etkinliği artıran silimarinin kombinasyon tedavileri için uygun bir aday olabileceğini düşünüyoruz. Ancak silimarinin gerçek potansiyelinin açığa çıkarılabilecek daha detaylı moleküler ve in vivo çalışmalara da ihityaç bulunmaktadır. KAYNAKLAR AbouZid S. (2012). Silimarin, Natural Flavonolignans from Milk Thistle, Phytochemicals - A Global Perspective of Their Role in Nutrition and Health, Dr Venketeshwer Rao (Ed.), ISBN: 978-953-51-0296-0 Agarwal R, Rana P.Singh, Anil K.Tyagi, Jifu Zhaoand, Silymarin inhibits growth and causes regression of established skin tumors in SENCAR mice via modulation of mitogen-activated protein kinases and induction of apoptosis. Carcinogenesis vol.23 no.3 pp.499–510, 2002 Arcamone F, Cassinelli G, Fantini G, Grein A, Orezzi P, Pol C, Spalla C. Adriamycin, 14-hydroxydaunomycin, a new antitumor antibiotic from S. peucetius var. caesius. Reprinted from Biotechnology and Bioengineering, Vol. XI, Issue 6, Pages 1101-1110 (1969). Biotechnol Bioeng. 2000 Mar 20;67(6):704-13. Danz, E.D., Skramsted, J., Henry, N., et al., 2009. Resveratrol prevents Doksorubisin cardiotoxicity through mitochondrial stabilization and the Sirt1 pathway. Free Radic. Biol. Med. 46, 1589–1597. Darcansoy İşeri Ö, Yurtcu E, Haberal M. et al. Corchorus olitorius (jute) extract induced cytotoxicity and genotoxicity on human multiple myeloma cells (ARH-77). Pharm Biol. 2013 Jun; 51(6):766-70 Dinçer Y, Kankaya S. DNA Hasarının Belirlenmesinde Comet assay, Türkiye Klinikleri J Med Sci 2010;30(4):1365-73 Hadaruga D.I. and Hadaruga N.G., Antioxidant Activity of Hepatoprotective Silimarin and Silybum marianum L. Extract Chem. Bull. "POLITEHNICA" Univ. (Timisoara) Volume 54(68), 2, 2009 Huber A, Thongphasuk P, Erben G, et al. Significantly greater antioxidant anticancer activities of 2,3-dehydrosilybin than silybin. Biochem Biophys Acta 1780(5): 837-847, 2008 Jin C, Li H, He Y, et al. Combination chemotherapy of doksorubisin and paclitaxel for hepatocellular carcinoma in vitro and in vivo. J Cancer Res Clin Oncol 136(2): 267-274, 2010. Jose´ L. Quiles , Jesu´ s R. Huertas , Maurizio Battino , Jose´ Mataix , M.Carmen Ramı´rez-Tortosa Antioxidant nutrients and adriamycin toxicity Toxicology 180 (2002) 79/95 Kim TH1, Shin YJ, Won AJ, Lee BM, Choi WS, Jung JH, Chung HY, Kim HS. Resveratrol enhances chemosensitivity of doksorubisin in multidrugresistant human breast cancer cells via increased cellular influx of doksorubisinBiochim Biophys Acta. 2014 Jan;1840(1):615-25. doi: 10.1016/j.bbagen.2013.10.023 Lee DG1, Kim HK, Park Y, Park SC, Woo ER, Jeong HG, Hahm KS. Grampositive bacteria specific properties of silybin derived from Silybum marianum. Arch Pharm Res. 2003 Aug;26(8):597-600 Lee YS, Jang KA, Cha JD. Synergistic antibacterial effect between silibinin and antibiotics in oral bacteria. J Biomed Biotechnol. 2012;2012:618081 Liu RH. Potential synergy of phytochemicals in cancer preventi-on: mechanism of action. J.Nutr. 2004 Dec;134(12 Suppl):3479S-3485S. Malla S. , Niraula N.P., Singh B, Liou K. , Sohng J.K. Limitations in doksorubisin production from Streptomyces peucetius Microbiological Research Volume 165, Issue 5, 20 July 2010, Pages 427–435. Öktem G, Ayla Ş, Tuna S et al. Doksorubisinin Spheroid Hücre Kültürlerinde MCF-7 Hücreleri Üzerine Etkisi Türkiye Klinikleri J Med Sci 2005, 25: 337-342 P. K. Kalla, S. Chitti, S. T. Aghamirzaei et al. Anti-Cancer Activity of Silimarin on MCF-7 and NCIH-23 Cell Lines, 2014;Advances in Biological Research 8 (2): 57-61 Ramakrishnan G1, Lo Muzio L, Elinos-Báez CM et al. Silimarin inhibited proliferation and induced apoptosis in hepatic cancer cells. Cell Prolif. 2009Apr;42(2):229-40 Ramasamy K, Agarwal R. Multitargeted therapy of cancer by silimarin. Cancer Lett 269(2): 352-362, 2008 Rastegar H, Ahmadi Ashtiani H, Anjarani S. et al. The Role Of Milk Thistle Extract İn Breast Carcinoma Cell Line (MCF-7) Apoptosis With Doksorubisin. Acta Med Iran. 2013 Sep;51(9):591-8. Riddick DS, Lee C, Ramji S, et al. Cancer chemotherapy and drug metabolism. Drug Metab Dispos 33(8): 1083-1096, 2005. Rifki F, Dyaningtyas Dewi P.P, Nunuk A. N. et al. Hesperidin as a preventive resistance agent in MCF-7 breast cancer cellsline resistance to doksorubisin Asian Pac J Trop Biomed 2014; 4(3): 228-233 Schwartz JL. The dual roles of nutrients as anti-oxidants and pro-oxidants: their effects on tumor cell growth.. J Nutr. 1996 Apr;126(4 Suppl):1221S7S. Tyagi AK, Agarwal C, Chan DC, et al. Synergistic anti-cancer effects of silibinin with conventional cytotoxic agents doksorubisin, cisplatin and carboplatin against human breast carcinoma MCF-7 and MDA-MB468 cells. Oncol Rep 11(2): 493-499, 2004. Tyagi AK, Singh RP, Agarwal C, et al. Silibinin strongly synergizes human prostate carcinoma DU145 cells to doksorubisin-induced growth inhibition, G2-M arrest, and apoptosis. Clin Cancer Res 8(11): 3512-3519, 2002. Ergin V, Doğan İ, Cumaoğlu A. et al. MCF-7 meme kanseri hücre hattında doksorubisin ve monensinin hücre çoğalması ve sağ kalım ile ilişkili gen ifadelenme düzeyleri üzerine etkisi. Journal of Experimental and Clinical Medicine 28 (2011) 59-63 Václavíková, R., Kondrová, E., Ehrlichová, M., et al., 2008. The effect of flavonoid derivatives on Doksorubisin transport and metabolism. Bioorg. Med. Chem. 16, 2034–2042. Yurtcu E, Işeri O, Sahin F. Genotoxic and cytotoxic effects of doksorubisin and silimarin on human hepatocellular carcinoma cells. Hum Exp Toxicol. doi: 10.1177/0960327114529453, 2014 Zhang S1, Morris ME. Effects of the flavonoids biochanin A, morin, phloretin, and silimarin on P-glycoprotein-mediated transport.J Pharmacol Exp Ther. 2003 Mar;304(3):1258-67 Zhang, F.Y., Du, G.J., Zhang, L., et al., 2009. Naringenin enhances the anti-tumor effect of Doksorubisin through selectively inhibiting the activity of multidrug resistanceassociated proteins but not P-glycoprotein. Pharm. Res. 26, 914–925. Zhu W., Zhang JS., Young CY. Silimarin inhibits function of the androgen receptor by reducing nuclear localization of the receptor in the human prostate cancer cell line LNCaP. Carcinogenesis. 2001 Sep;22(9):1399403 Zi X, Feyes D. K. and Agarwal R. Anticarcinogenic effect of a flavonoid antioxidant, silimarin, in human breast cancer cells MDA-MB 468: induction of G1 arrest through an increase in Cip1/p21 concomitant with a decrease in kinase activity of cyclin-dependent kinases and associated cyclins. Clin Cancer Res 1998 4:1055-1064. Al-Ghamdi S. S. Time and Dose Dependent Study of Doksorubisin Induced du-145 Cytotoxicity. Drug Metabolism Letters, 2008, 2, 000-000 1. http://globocan.iarc.fr/Pages/fact_sheets_cancer.aspx, (Son Erişim Tarihi: 11.05.2014) 2. http://sbu.saglik.gov.tr/Ekutuphane/kitaplar/istaturk2012.pdf Erişim Tarihi: 11.05.2014) (Son