PDF İndir - Adnan Menderes Üniversitesi
Transkript
PDF İndir - Adnan Menderes Üniversitesi
Tralleis Elektronik Dergisi http://dergi.etralleis.com e-TRALLEIS 3 (2014) 11-17 ©ADÜ Katalaz İmmobilizasyonu için Manyetik Gümüş Nanopartiküllerin Sentezlenmesi ve Karakterizasyonu Sibel CAN1, Meltem KAPLAN1, Murat UYGUN2, Deniz AKTAŞ UYGUN1 2 1 Adnan Menderes Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü, Aydın Adnan Menderes Üniversitesi Koçarlı Meslek Yüksekokulu Bitkisel ve Hayvansal Üretim Bölümü, Aydın ESER BİLGİSİ Araştırma Makale - Fen Bilimleri Sorumlu yazar: Murat UYGUN, muygun@adu.edu.tr Yayına Kabul Tarihi: 12.05.2014 Özet: Yapılan bu çalışmada katalaz enziminin geri dönüşümlü immobilizasyonu için manyetik gümüş nanopartiküller hazırlanmıştır. Bu amaçla, ilk olarak manyetik çekirdek demir(II) ve demir(III) çözeltilerinin bazik ortamdaki reaksiyonu ile sentezlenmiştir. Manyetik çekirdeğin üzeri gümüş ile kaplanarak manyetik gümüş nanopartiküller hazırlanmıştır. Sentezlenen manyetik gümüş nanopartiküller N-asetil sistein ile fonksiyonelleştirilmiştir ve Fe3+ ile kompleksleştirilmiştir. Hazırlanan manyetik gümüş nanopartiküllerin karakterizasyonu SEM, AFM ve EDX ölçümleri ile gerçekleştirilmiştir. Sentezlenen manyetik gümüş nanopartiküllerin katalaz immobilizasyonu etkinliği farklı tampon sistemlerinde araştırılmış ve katalaz immobilizasyonuna pH’ın etkisi incelenmiştir. Anahtar kelimeler: Katalaz, immobilizasyon, manyetik gümüş nanopartiküller, IMAK Synthesis and Characterization of Magnetic Silver Nanoparticles for Catalase Immobilization Abstract: In this presented work, magnetic silver nanoparticles were synthesized for the reversible immobilization of catalase. For this, magnetic core was synthesized by the reaction of iron(II) and iron(III) in basic medium. Magnetic silver nanoparticles were prepared by covering the magnetic core with a thin layer of silver. Synthesized magnetic silver nanoparticles were functionalized N-acetyl cysteine and complexed with Fe3+. Characterization of prepared magnetic silver nanoparticle was carried out with SEM, AFM and EDX analysis. Catalase immobilization efficiency of synthesized magnetic silver nanoparticles was investigated in various buffer systems and the effect of medium pH on the catalase immobilization was studied. Key words: Catalase, immobilization, magnetic silver nanoparticle, IMAC Giriş Günümüzde nanometre boyutlarına sahip maddelerin anlaşılması ve kontrolü olarak tanımlanan nanoteknoloji, boyutu 100 nm’den küçük aygıtların üretilmesi ve uygulamalarını da içermektedir (Mamalis, 2007). Nanoteknoloji son zamanlarda oldukça ilgi çekmektedir ve birçok teknolojik uygulamaya uyarlanmıştır. Bunun temel nedeni, partikül boyutunun küçülmesine karşı değişen ve gelişen eşsiz fiziksel ve kimyasal özelliklerdir. Partikül boyutu küçüldükçe yüzey alanı/hacim oranı artmakta ve birim hacim başına çok yüksek yüzey alanlarına ulaşılabilmektedir. Ayrıca, boyut küçülmesine paralel olarak partiküllerin optik özellikleri de değişmekte ve böylece partiküllerin optik ve floresans uygulamalarında yeni kullanım alanları ortaya çıkmaktadır. Nanopartiküller bununla birlikte, materyallerin sertliklerinin ve esnekliklerinin 11 S.CAN, M. KAPLAN, M. UYGUN, D. AKTAŞ UYGUN arttırılmasında ve polimerik yapıların güçlendirilmesinde kullanılmaktadır (Papazoglou ve Parthasarathy, 2007). yer değiştirir. Böylece proteinin kromatografik desteğe bağlanması sağlanmış olur (Denizli ve Küfrevioğlu, 2007). Manyetik nanopartiküller; proteinler ve enzimlerin immobilizasyonunda, biyoayırmada, immunoanalizlerde, ilaç salınım sistemlerinde ve biyosensörler uygulamaları başta olmak üzere pek çok alanda kullanılmaktadır (Mandal ve ark., 2005). Bir destek materyali olarak manyetik nanopartiküllerin kullanılmasının pek çok avantajı bulunmaktadır: i) İyi kütle transferi özelliklerine sahip olması; ii) Basit bir mıknatısla çok kolay bir şekilde kompleks ortamlardan ayrılabilmesi ve böylece immobilize enzimlerin defalarca kullanılabilmesine olanak sağlaması; iii) Geniş spesifik yüzey alanları sayesinde etkili enzim immobilizasyonuna neden olması (Kuroiwa ve ark., 2008) bunlar arasındadır. Katalaz; hayvanlar, bitkiler ve mikroorganizmalarda yaygın olarak bulunan bir enzimdir ve toksik hidrojen peroksitin bertaraf edilmesinde etkili bir rol oynamaktadır. Katalaz enzimi bu özelliğiyle biyolojik ve biyokimyasal sistemlerde antioksidan aktivite göstermekte ve bu şekilde hücreyi oksidatif hasarlara karşı korumaktadır. Katalaz, tetrahedral düzende organize olmuş dört özdeş alt birimden meydana gelen bir tetramerdir ve her bir alt birim yaklaşık 15 kDa’dur. Enzim aktif merkezinde bir hem grubu içermektedir (Scibior ve Czeczot, 2006). Sunulan bu çalışmada, katalaz immobilizasyonu için kullanılacak olan manyetik gümüş nanopartiküllerin sentezi ve karakterizasyonu çalışmaları yapılmıştır. Sentezlenen manyetik gümüş nanopartiküller N-asetil sistein ile fonksiyonelleştirilmiş ve Fe3+ ile şelatlaştırılmıştır. Hazırlanan bu immobilize metal iyon afinite desteği katalaz adsorpsiyonunda kullanılmış ve adsorpsiyona ortam pH’ının etkisi incelenmiştir. Gümüş nanopartiküller eşsiz elektronik, mekanik, manyetik ve optik özelliklerinden dolayı günümüzde oldukça ilgi görmekte ve paketleme ve işleme sistemlerinde, lastik, tekstil, kozmetik ve gıda ürünlerinde, yara bakımı ürünlerinde, terapötik aletlerde, teşhis ve ilaç salınımı gibi medikal uygulamalarda oldukça yaygın olarak kullanılmaktadır (Khan ve ark., 2011). Materyal ve Yöntem İmmobilize metal iyon afinite kromatografisi (IMAK), bir protein molekülünün metal iyon afinitesi etkileşimleri yardımıyla metal iyonuna bağlanarak saflaştırılması temeline dayanmaktadır (Porath ve ark., 1975). Kimyasallar Katalaz, N-asetil sistein, gümüş nitrat ve amonyak Sigma Firmasından (Steinheim, Almanya); demir(III) klorür, demir(II) klorür, KH2PO4 ve K2HPO4 Merck Firmasından (Darmstadt, Almanya); asetik asit, sodyum asetat ve etanol Riedel-de Haen Firmasından (Seelze, Almanya); diğer tüm kimyasallar ise Aldrich Firmasından (Milwaukee, ABD) temin edilmiştir. IMAK ile proteinlerin saflaştırılması ve ayrılması işlemleri yanında saflaştırma işlemi sonunda protein denatüre olmadığı için aktivitesini de korumaktadır. IMAK’de proteinlerin adsorpsiyon işlemi, protein üzerindeki elektron verici gruplar ile immobilize edilmiş bir metal iyonu arasındaki koordinasyonun oluşumuna dayanır. En yoğun kullanılan metal iyonları elektron çifti kabul etme eğiliminde olan Cu(II), Ni(II), Zn(II), Co(II) ve Fe(II) gibi geçiş metal iyonlarıdır. Kromatografik destek materyaline bağlanan şelat oluşturucu bileşiklerdeki N, S ve O gibi elektron verici atomların varlığı, metaller ile koordinasyon bağı yapılmasını sağlar. Metal iyonunun boş koordinasyon bölgeleri normalde su molekülleri ile işgal edilirken, protein adsorpsiyonu sırasında proteinden gelen uygun elektron verici gruplar ile N-Asetil Sistein Bağlı Manyetik Gümüş Nanopartiküllerin Sentezlenmesi Manyetik gümüş nanopartiküller kimyasal indirgenme metodu kullanılarak sentezlenmişlerdir (Akduman ve ark., 2013). Bu amaçla, 1.08 g demir(III) klorür 100 mL saf su içerisinde, 0.396 g demir(II) klorür 100 mL saf su içerisinde çözünmüştür. Hazırlanan çözeltiler birbirine karıştırılarak üzerine 20.0 mL % 26’lık amonyak çözeltisi ilave edilmiş ve 1 saat oda sıcaklığında 100 rpm hızda karıştırılmıştır. Sentezlenen Fe3O4 manyetik nanopartiküller bir 12 S.CAN, M. KAPLAN, M. UYGUN, D. AKTAŞ UYGUN mıknatıs yardımı ile ayrılarak iki kez 100 mL saf su ile yakınmıştır (Gupta ve Gupta, 2005). Manyetik nanopartiküllerin yüzeyini gümüş ile kaplamak üzere, taze olarak hazırlanmış bu manyetik nanopartiküllerin üzerine 100 mL saf su ilave edilmiş ve 0.0852 g gümüş nitrat eklenerek 100 rpm hızda karıştırılmış ve 10 mg sodyum borhidrür ile indirgenmiştir. Sentezlenen kahverengimsi manyetik gümüş nanopartiküller bir mıknatıs kullanılarak ayrılmış ve 100 mL saf su ile yıkanmıştır (Xu ve ark., 2007). Hacmi 100 mL’ye tamamlanan manyetik gümüş nanopartiküllerin üzerine 0.409 g N-asetil sistein ilave edilmiş ve 10 mg sodyum borhidrür ile indirgenmiş ve 30 dakika oda sıcaklığında bir manyetik karıtıcı yardımı ile 100 rpm hızda karıştırılmıştır. Sentezlenen N-asetil sistein bağlı manyetik gümüş nanopartiküller bir mıknatıs yardımı ile ayrılmış, 100 mL saf su ile iki defa yıkanmış ve etüvde 65 °C’de örnek ağırlığı sabit tartıma gelinceye kadar 3 gün boyunca kurutulmuştur. N-asetil sistein bağlı gümüş nanopartiküllerin sentez basamakları Şekil1’de şematik olarak gösterilmiştir. Fe3+ ile Şelatlaştırılmış N-asetil Sistein Bağlı Gümüş Nanopartiküllerin Sentezlenmesi N-asetil sistein bağlı gümüş nanopartiküllere Fe3+ şelasyonu işlemi aşağıdaki gibi gerçekleştirilmiştir: Sentezlenmiş ve kurutulmuş N-asetil sistein bağlı gümüş nanopartiküllerin 3.5 gramı alınarak 100 mL demir(III) nitrat çözeltisi (2.5 x 10-4 M, pH: 5.0) ile 24 saat süre karıştırılmıştır. Hazırlanan Fe3+ ile şelatlaştırılmış N-asetil sistein bağlı gümüş nanopartiküller manyetik olarak ayrılmış ve 100 mL saf su ile iki defa yıkanarak katalaz adsorpsiyonunda kullanılmıştır (Akduman ve ark., 2013). N-asetil sistein bağlı gümüş nanopartiküller üzerine Fe3+ şelasyonu basamakları Şekil 1’de şematik olarak gösterilmiştir. Şekil 1. N-asetil bağlı manyetik gümüş nanopartiküllerin sentezi ve Fe3+ ile şelatlaştırılmasının şematik gösterimi. 13 S.CAN, M. KAPLAN, M. UYGUN, D. AKTAŞ UYGUN nanopartiküllere bağlanan katalaz miktarı hesaplanmıştır (Uygun ve ark., 2012). Q = [(C0-C)V]/m Eşitlik 1. Burada, Q birim nanopartikül kütlesi başına bağlanan katalazın kütlesi (mg/g); C0 ve C sırası ile adsorpsiyondan önceki sonraki katalaz derişimleri (mg/mL); V toplam çözelti hacmi ve m denemelerde kullanılan nanopartikül kütlesidir (g). Fe3+ ile Şelatlaştırılmış N-asetil Sistein Bağlı Gümüş Nanopartiküllerin Karakterizasyonu Sentezlenen manyetik gümüş nanopartiküllerin yüzey morfolojisi, boyutu ve şekli SEM (taramalı elektron mikroskobu) ve AFM (atomik kuvvet mikroskobu) cihazları kullanılarak incelenmiştir. SEM analizleri için, manyetik gümüş nanopartiküller kurutulmuş ve toz halindeki örneklerin üzeri altın ile kaplanmış ve SEM cihazı (Philips, XL-30S FEG, Hollanda) kullanılarak fotoğraflanmıştır. AFM analizi için, manyetik gümüş nanopartikül çözeltisi bir cam tabak (1.0 cm x 1.0 cm) üzerine yayılmış, kurutulmuş bir AFM cihazına (Digital Instruments, MMSPM Nanoscope IV, ABD) yerleştirilerek taranmıştır. Manyetik nanopartiküller üzerine N-asetil sistein bağlanması EDX (enerji dağılımlı X-ışını) cihazı (LEO, EVO40, Carl Zeiss NTS, ABD) kullanılarak saptanmıştır. Nanopartiküllere bağlanan N-asetil sistein miktarı bu analizden elde edilen kükürt miktarından yola çıkarak stokiometrik olarak hesaplanmıştır. Bulgular ve Tartışma Fe3+ ile Şelatlaştırılmış N-asetil Sistein Bağlı Gümüş Nanopartiküllerin Karakterizasyonu Sentezlenen manyetik gümüş nanopartiküllerin bir fotoğrafı Şekil 2’de gösterilmiştir. Şekil 2’de görüldüğü gibi, gümüş nanopartiküller bir mıknatıs yardımı ile kolaylıkla toparlanabilmektedir. (A) Fe3+ ile Şelatlaştırılmış N-asetil Sistein Bağlı Gümüş Nanopartiküllere Katalaz İmmobilizasyonu ve İmmobilizasyona pH’ın Etkisi Sentezlenen Fe3+ ile şelatlaştırılmış N-asetil sistein bağlı gümüş nanopartiküllere katalaz immobilizasyonu kesikli sistemde incelenmiştir. Bu amaçla, manyetik gümüş nanopartiküller katalaz çözeltisinin sulu çözeltisi ile 2 saat boyunca +4 °C’lik su banyosunda 100 rpm karıştırma hızında muamele edilmiştir. Katalaz adsorpsiyonuna ortam pH’ının etkisinin incelenmesi için farklı pH’larda tampon çözeltiler kullanılmıştır. Bu amaçla, farklı pH’larda tamponlar (pH 3.0-5.0 asetat tamponu; pH 6.0-8.0 fosfat tamponu; pH 9.0 karbonat tamponu) kullanılarak 6.0 ml’lik katalaz çözeltileri (0.05 mg.mL-1) hazırlanmış ve üzerlerine 0.6 mg nanopartikül eklenerek 2 saat süre ile 100 rpm hızda manyetik olarak karıştırılmıştır. Adsorpsiyon işlemi başında ve sonunda ortamda bulunan katalaz miktarı spektrofotometrik olarak 280 nm’de tayin edilmiştir (Shimadzu, 1601, Japonya) ve Eşitlik 1. gereğince manyetik (B) Şekil 2. Fe3+ ile şelatlaştırılmış N-asetil sistein bağlı gümüş nanopartiküllerin suda süspanse olmuş (A) ve bir mıknatıs ile ayrılmış (B) durumlarını gösteren fotoğraf. Fe3+ ile şelatlaştırılmış N-asetil sistein bağlı gümüş nanopartiküllerin yüzey özellikleri ve şekli SEM analizleri ile incelenmiştir. Şekil 3’de sentezlenen gümüş nanopartiküllerin SEM fotoğrafı görülmektedir. Şekilden de görüldüğü üzere, nanopartiküller küresel formdadır ve birbirlerine yakın konumda istiflenerek agregatlaşmış haldedirler. 14 S.CAN, M. KAPLAN, M. UYGUN, D. AKTAŞ UYGUN Şekil 3. Fe3+ ile şelatlaştırılmış N-asetil sistein bağlı gümüş nanopartiküllerin SEM fotoğrafı. Hazırlanan gümüş nanopartiküllerin şekil ve boyut özellikleri AFM kullanılarak incelenmiştir ve Fe3+ ile şelatlaştırılmış N-asetil sistein bağlı gümüş nanopartiküllerin AFM fotoğrafı Şekil 4’de gösterilmiştir. Şekil 4’den görüleceği üzere, sentezlenen nanopartiküller küresel formdadır ve ortalama partikül çapı 43 nm olarak ölçülmüştür. Şekil 4. Fe3+ ile şelatlaştırılmış N-asetil sistein bağlı gümüş nanopartiküllerin AFM fotoğrafı. 15 S.CAN, M. KAPLAN, M. UYGUN, D. AKTAŞ UYGUN Fe3+ ile şelatlaştırılmış N-asetil sistein bağlı gümüş nanopartiküllerin EDX analizi partiküllerin kimyasal bileşimi hakkında bilgi vermektedir. Şekil 5’de manyetik gümüş nanopartiküllerin EDX analizi sonuçları görülmektedir. Şekil’den de görüldüğü üzere, hazırlanan nanopartiküller Fe, O, Ag, N, C ve S atomlarından meydana gelmektedir. Gümüş nanopartiküller üzerine bağlanan N-asetil sistein miktarı EDX analiz sonuçlarına göre hesaplanmıştır ve bağlanan N-asetil sistein miktarı kükürt stokiometrisi kullanılarak 268.75 µmol.g-1 olarak hesaplanmıştır. cps/eV 30 25 S 20 N C Ag O Fe S Ag Fe 15 10 5 0 0 1 2 3 4 keV 5 6 7 8 9 Şekil 5. Fe ile şelatlaştırılmış N-asetil sistein bağlı gümüş nanopartiküllerin EDX spektrumu. 3+ Fe3+ ile Şelatlaştırılmış N-asetil Sistein Bağlı Gümüş Nanopartiküllere Katalaz İmmobilizasyonu ve İmmobilizasyona pH’ın Etkisi Fe3+ ile şelatlaştırılmış N-asetil sistein bağlı gümüş nanopartiküllere katalaz immobilizasyonuna pH’ın etkisi pH 3.0-9.0 aralığında incelenmiştir ve elde edilen sonuçlar Şekil 6’da gösterilmiştir. Şekil’den görüldüğü üzere, maksimum katalaz adsorpsiyonu pH 4.0 asetat tamponu kullanılarak elde edilmiştir ve 443.11 mg katalaz.g-1 nanopartikül olarak hesaplanmıştır. Bu pH değerinin üzerinde ve altında adsorplanan katalaz miktarı azalmıştır. IMAK’de protein adsorpsiyonu temelde metal iyonları ile proteinlerin amino asit birimleri arasındaki şelatlayıcı bağlara bağlıdır. Katalazın izoelektrik noktası 5.4’dür ve bu pH değerinde net bir yüke sahip değildir (Samejima ve ark, 1962). pH 4.0 noktasında katalaz iyonize olma eğilimdedir ve bu da IMAK desteği üzerine katalaz adsorpsiyonu etkilemiş olabilir (Erzengin ve ark., 2011; Wong ve ark., 1991). Şekil 6. Fe3+ ile şelatlaştırılmış N-asetil sistein bağlı gümüş nanopartiküllere katalaz immobilizasyonuna pH’ın etkisi (katalaz derişimi: 0.05 mg/ml; inkübasyon zamanı: 2 saat; sıcaklık: 25 °C). Sonuç Bu çalışmada, manyetik gümüş nanopartiküllerin sentezi, modifikasyonu ve Fe3+ ile şelasyonu ve katalaz immobilizasyonunda kullanımı rapor edilmiştir. Sentezlenen nanopartiküller SEM, AFM ve EDX kullanılarak karakterize edilmiş ve partikül boyutunu yaklaşık 69 nm olduğu ve küresel yapıya sahip olduğu bulunmuştur. Sentezlenen nanopartiküllere katalaz immobilizasyonun farklı pH’lardaki tampon çözeltilerinin etkisi incelenmiş ve maksimum katalaz adsorpsiyonun pH 4.0 asetat tamponu 16 S.CAN, M. KAPLAN, M. UYGUN, D. AKTAŞ UYGUN kullanılarak elde edildiği bulunmuştur. Sonuç olarak, sentezlenen nano boyuttaki metal iyon afinite desteğinin katalaz adsorpsiyonu kapasitesi oldukça yüksek olmasından ve kompleks ortamlardan dahi manyetik olarak basitçe ayrılabilme potansiyeline sahip olmasından dolayı katalaz adsorpsiyonunda ayırma teknolojisinde ve immobilize formda ise biyoteknolojik uygulamalarda etkili bir şekilde kullanılabileceği ön görülebilir. Green 5 attached supermacroporous monolithic cryogel. Applied Biochemistry and Biotechnology, 167: 552-563. Wong, J.W., Albrigth, R.L. Wang, N.H.L. 1991. Immobilized metal ion affinity chromatography (IMAC) chemistry and bio-separation applications. Separation and Purification Methods, 20: 49-106. Xu, Z., Hou, Y., Sun, S. 2007. Magnetic core/shell Fe3O4/Au and Fe3O4/Au/Ag nanoparticles with tunable plasmonic properties. Journal of American Chemical Society, 129: 8698-8699. KAYNAKLAR Akduman, B., Uygun, M., Uygun, D.A., Antalik, M. 2013. Fe3O4 magnetic core coated by silver and functionalized with N-acetyl cysteine as novel nanoparticles in ferritin adsorption. Journal of Nanoparticle Research, 15: 1564. Denizli, A., Küfrevioğlu, Ö.İ. 2007. Protein kromatografisi ve yeni nesil polimerik sistemler, Yaz Okulu Notları, pp. 133, Erzurum. Erzengin, M., Ünlü, N., Odabaşı, M. 2011. A novel adsorbent for protein chromatography: supermacroporous monolithic cryogel embedded with Cu2+-attached sporopollenin particles. Journal of Chromatography A, 1218: 484-490. Gupta, A.K., Gupta, M. 2005. Synthesis and surface engineering of iron oxide nanoparticles for biomedical applications. Biomaterials, 26: 39954021. Khan, Z., Al-Thabaiti, S.A., Obaid, A.Y., Al-Youbi, A.O. 2011. Preparation and characterization of silver nanoparticles by chemical reduction method. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 82: 513517. Kuroiwa, T., Noguchi, Y., Nakajima, M., Sato, S., Mukataka, S., Ichikawa, S. 2008. Production of chitosan oligosaccharide using chitosanase immobilized on amylase-coated magnetic nanoparticles. Process Biochemistry, 43: 62-69. Mamalis, A.G. 2007. Recent advances in nanotechnology. Journal of Materials Processing, 181: 52-58. Mandal, M., Kundu, S., Ghosh, S.K., Panigrahi, S., Sau, T.K., Yusuf, S.M., Pal, T. 2005. Magnetite nanoparticles with tunable gold silver shell. Journal of Colloid Interface Science, 286: 187-194. Papazoglou, E.S., Parthasarathy, A. 2007. BioNanotechnology, Morgan & Claypool Pub. ABD. Porath, J., Carlsson, J.A.N., Olsson, I., Belfrage G. 1975. Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation. Nature, 258: 598599. Samejima, T., Kamata, M., Shibata, K. 1962. Dissociation of bovine liver catalase at low pH. The Journal of Biochemistry, 51: 181-187. Scibior, D., Czeczot, H. 2006. Catalase: structure, properties, functions. Postepy Higieny i Medycyny Doswiadczalnej, 60: 170-180. Uygun, D.A., Akduman, B., Uygun, M., Akgöl, S., Denizli, A. 2012. Purification of papain using Reactive 17