Slayt 1 - XXVII. Ulusal Biyokimya Kongresi / 3
Transkript
Slayt 1 - XXVII. Ulusal Biyokimya Kongresi / 3
METABOLİK ENZİM VE TRANSPORTER GENLERİNİN EKSPRESYON ANALİZİ İLE METABOLİK YOLLARIN AYDINLATILMASI Prof.Dr. Ö.İrfan KÜFREVİOĞLU Atatürk Üniversitesi Fen Fakültesi Kimya Bölümü Biyokimya Anabilim Dalı Erzurum/TURKEY GEN Moleküler anlamda gen, fonksiyonel bir ürün; rRNA (ribozomal RNA), tRNA (transfer RNA) ve polipeptit zincirini kodlayan DNA dizisi olarak tanımlanabilir. Protein genleri, hücreler tarafından yapılan proteinlerin çeşitlerini tayin ederek etkilerini gösterirler. GEN EKSPRESYONU DNA’da mevcut olan genetik bilginin ifade edilmesi yani bilginin kullanılması olayıdır. Replikasyon Normal hücrelerde genetik bilginin akışı şu şekilde olur; Gen mRNA Transkripsiyon Protein Translasyon Hayvan genomları, 15.000 (Drosophila) ve 23.000 (insan, fare) arasında gen ihtiva ederler; bu genlerin büyük kısmı düzenleyici proseslerde gerekli olan proteinleri kodlarlar. Bu genlerin büyük çoğunluğunun sekanslarının bulunması, temelini teşkil eden biyolojik regülasyonun kompleks genetik ve protein etkileşmelerini araştırma imkanlarına neden olmuştur. Birçok bileşen ihtiva eden düzenleyici metabolik ağın anlaşılması için, her bir komponentin ekspresyon zamanının ayrıntılı bir şekilde önemli bir avantaj sağlar. bilinmesi Gen ekspresyonu; Northern analizi, Rnaz koruma ölçümleri, gen arrayleri, RNA in situ hibridizasyonu ile protein seviyesinde yapılan Western Blot ve immunohistokimya gibi metotları içeren çok geniş bir spektrumda incelenebilir. RNA in situ hibridizasyonu vasıtasıyla gen ekspresyon analizine dayanarak, binlerce genin uygun zaman periyodunda ekspresyon örneklerinin belirlenmesi için etkili teknolojilere gerek vardır. Değişik dokularda gen ekspresyon örneklerinin tayini ve gösterilmesine izin veren tamamen otomatik olarak düzenlenmiş böyle bir sistem, Göttingen Max-Planck Enstütüsünde geliştirilmiştir. Ayrıca RNA in situ hibridizasyonu vasıtasıyla elde edilen gen ekspresyon verilerinin otomotik mikroskopik taranması için bilgisayar programı oluşturulmuştur. Bu çalışmada, bazı merkezi metabolik yol enzim genlerinin (TCA devri, glikoliz yolu, bazı lipid ve amino asit metabolizmaları vb.) cDNA’larının üretimi tarafımızdan gerçekleştirilmiştir. Antisens mRNA sentezi ve in situ hibridizasyon işlemleri, Prof. Dr. Gregor Eichele gözetiminde Göttingen Max-Planck Enstitüsünde burslu bölümümüz elemanları Dr. Murat ÇANKAYA ve Dr. Harun BUDAK tarafından yapılmıştır. Glutamat metabolizması genleri için, 12,5, 14,5, 15,5 günlük fare embriyoları ile P56 yetişkin beyninde, diğer genler için 14,5 günlük fare embriyosunda in situ hibridizasyon yöntemi ile gen ekspresyon örnekleri çıkarılarak http://www.genepaint.org/ ve http://www.metscout.mpg.de/ web sitesine konulmuştur (toplam 750 gen). Bu çalışmaların diğer teknolojilerle kombinasyonu sonucu, beyin ve diğer dokuların gelişimi ve fonksiyonlarının temelini oluşturan genetik ve biyokimyasal ağın anlaşılmasına ışık tutulacaktır. In Situ Hibridizasyon Yöntemiyle Gen Ekspresyon Analizi Geffers, L. İlk önce çalışılacak olan enzim genlerinin taraması yapıldı. Çalışılacak genler belirlendikten sonra bu genler için 20 bazlık spesifik primerler hazırlandı. Daha sonra mRNA’lardan revers transkriptaz enzimi vasıtasıyla elde edilen komplementer DNA (cDNA) kütüphanesi kullanılarak PCR ile istenilen gene spesifik yaklaşık 1000 bazlık cDNA probu sentezlendi. Çoğaltılan bu cDNA probundan ilgili genin mRNA’sına komplementer olan bir antisens mRNA sentezlendi. Sentezlenen antisens mRNA, bir robot kullanılarak lam üzerine serilmiş fare embriyosu veya yetişkin fare beyni üzerinden geçirildi. Lam üzerindeki fare mRNA’sıyla, sentetik antisens mRNA probu hibridize edildi ve daha sonra boyama tekniğiyle genin nerelerde ekspresyona uğradığı belirlendi. PRİMER DİZAYNI İlgili gen için sekans bilgisi ve yer bilgisi tam olarak bulundu. Genin spesifik probunu elde etmek için gen sekansında en iyi bölge seçildi. Genin spesifik primerinin seçimi için primer 3 bilgisayar programı kullanıldı. Genin spesifik probu üzerinde son kontrol yapıldı. Dizayn edilen primerlerden; left primerin ucuna T7, right primerin ucuna SP6 promotorları takılarak sipariş edildi. «www.ncbi.nlm.nih.gov» internet sayfası açıldı. 1 .«All Databases» kutucuğu tıklanır. 2. «Nucleotide» seçeneği seçilir. 3. Arama bölgesine aranacak genin adı «Atp9a» girilir. 4. «Search» tıklanır. Buradan ilgili genimizi çalışmak istediğimiz organizma tıklanır. Aranılan genle ilgili tüm organizma ların listesi Yalnızca ilgili genimizin listelendiği sayfa İlgili genimizin linkine tıklayarak spesifik özelliklerinin ve nükleotid sekansının bulunduğu sayfaya gideriz İlgili gene ait çeşitli spesifik bilgileri içeren veri tabanı İlgili gene ait çeşitli spesifik bilgilerin bulunduğu internet sayfası üst bölüm İlgili genin nükleotid sekansının tamamı seçilerek blastlama yapmak üzere yeniden «www.ncbi.nlm.nih.gov» internet sayfasına gidilir. İlgili gene ait çeşitli spesifik bilgilerin bulunduğu internet sayfası alt bölüm 1. «www.ncbi.nlm.nih.gov» sayfasının altında bulunan «BLAST» linki tıklanır. 2. «nucleotide blast» linki tıklanarak blastlama sayfasına gidilir. 1. Tüm nükleotid dizisi blastlanmak üzere yapıştırılır. 2. «Mouse genomic + transcript» seçeneği işaretlenir. 3. «BLAST» linki tıklanarak genin homoloji sayfasına gidilir. Seçilen Bölge: Primer ve Prob dizaynı için kullanılacak gen bölgesi Query Cover: blastlanan sekansının diğer genlerle ile homolojisinin yüzde değeri Sekans sayfasına gidilerek primer dizaynı yapılacak bölge seçilerek kopyalanır ve daha sonra primer dizaynı yapmak amacıyla «http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/» internet sayfasına gidilir. http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/ internet sayfasında iken; 1.Daha önce seçilerek kopyalanan sekans yapıştırılır. 2.İlgili genin adı yazılır. 3.Çoğaltılacak ürünümüzün baz çifti aralığı ayarlanır. 4.Dizayn etmekte olduğumuz primerlerin baz sayısı aralığı, Tm sıcaklıkları ve % GC oranları girilir. 5.Yukarıdaki işlemlerden program tarafından önerilen primer listesine ulaşmak için «Pick Primers» linki tıklanır. Program tarafından önerilen amaca uygun olan left primer (cacatttcttcctggggtgt) ve right primer (cctatcagcttgcgtgtgaa) sırasıyla kopyalanarak daha önce yapıldığı gibi blastlama yapılır. Programın verdiği bölge ile oynanarak en uygun primer, blastlama ile belirlenir. % 100 örtüşme gösteren bölge Left ve Right primer arasında kalan ve antisens mRNA probu olarak hazırlanacak bölge BLAST edildiğinde sadece Atp9a geni ile %100 olarak örtüşüyor ise teorik olarak probumuz hazır demektir. Atp9a (ATPase, class II, type 9A) Geni İçin Seçilen Primerler T7-Forward (Left) primer (43 baz): 5’-GCGTAATACGACTCACTATAGGG ACATGACGGACAGCATCCCG-3’ SP6-Revers (Right) primer (41 baz): 5’-GCGATTTAGGTGACACTATAG TTTCTGCCAGTGTAGAGAAC-3’ PCR Protokolü • cDNA kütüphanesi : 1,0 µL • dNTP (10mM) : 0,5 µL • Enhancer : 5,0 µL • Pri.T7-F(10 pmol/µL) : 1,0 µL • Pri.Sp6-R (10 pmol/µL) : 1,0 µL PCR Programı LİD 105oC WAITAUTO 1. PAUSE PRESS ENTER 2. T = 94oC de 2 dakika 3. PAUSE PRESS ENTER 4. T = 94oC de 20 saniye 5. T = 57oC de 20 saniye • PCR tamponu (10x) : 2,5 µL 6. T = 72oC de 1 dakika • H2O : 14,0 µL 7. GOTO 4 REP 35 • Taq Poli. (5U/ µL) : 0,2 µL 8. T = 72oC de 9 dakika 9. HOLD 4oC ENTER PCR Sonucunun Agaroz Jel Elektroforezi İle Görüntülenmesi In vitro Transkripsiyon (Antisens mRNA Üretimi) SP6 RNA polimeraz 1µl RNAsin 1µl Dig RNA labeling mix, 10x 2µl Tampon 10x 2µl DNA Templeyti 2µl DEPC- su 12µl 37oC’de 4-5 saat inkübasyon DNase I (10U/µl) 0,1µL 0,3 M MgCl2 0,08µL H 20 0,82µL 370C’ de 15 dakika inkübasyon yapılarak DNA’nın sindirilmesini sağlandı. In situ Hibridizasyon (ISH) • Fare embriyoları veya fare beyni özel ortamına gömüldü. • Mikrotom cihazıyla 20 mikronluk kesitler alındı ve slaytlar robota yerleştirildi. Geffers, L. Frozen kesitler için fiksasyon ve dehidrasyon yapıldı. Fiksasyon Basamağı; •%4’lük PFA ile 15-25 dakika inkübasyon •%0,9’luk NaCl ile 2 dakika inkübasyon •%0,9’luk NaCl ile 2 dakika inkübasyon Dehidrasyon Basamağı; 1.1xPBS ile 2 dakika inkübasyon 2.%0,9’luk NaCl ile 2 dakika inkübasyon 3. %30’luk Etanol ile 2 dakika inkübasyon 4.%50’lik Etanol ile 2 dakika inkübasyon 5.%70’lik Etanol ile 2 dakika inkübasyon 6.%80’lik Etanol ile 2 dakika inkübasyon 7.%95’lik Etanol ile 2 dakika inkübasyon 8.%100’lük Etanol ile 2 dakika inkübasyon 9.%100’lük Etanol ile 2 dakika inkübasyon 10.30ºC’lik fırında 3 dakika inkübasyon. Daha sonra slaytlar IHC için -80ºC’de muhafaza edilir. Geffers, L. Prehibridizasyon, Hibridizasyon, Yıkama ve NBT/BCIP kullanarak renk reaksiyonu uygulandı. Robotik ISH Geffers, L. Slaytlar lamelle kaplanarak saklandı, mikroskop altında incelendi ve skan edilerek internet ortamına aktarıldı. (www.genepaint.org ). Geffers, L. ISH’ın Prensibi DIG: Digoxigenin (Hapten) AP: Alkaline Phosphatase DIG labelled probe mRNA anti-DIG AP purple precipitate BCIP + NBT Geffers, L. Atp9a Geni İçin Ekspresyon Sonuçları www.genepaint.org Glutamat dehidrogenaz 1’in ekspresyon örnekleri (Glud1) www.genepaint.org 14,5 GÜNLÜK FARE EMBRİYOSU ÜZERİNDE ELDE EDİLEN IN SITU HİBRİDİZASYON SONUÇLARI • Atp9a (ATPaz 9A, class II): Beyin, dış sinir sistemi, merkezi sinir sistemi. • Atp10a (ATPaz 10A, class V): Ekspresyon olmadı. Atp9a Atp10a www.genepaint.org Cankaya, M. Et al., 2007, BMC Genomics Enerji metabolizmasındaki bazı enzimler bir stereotipik ekspresyon örnekleri gösterdiler. Idh3a (izositrat dehidrogenaz): İsositrat+ NADP+ -----> alpha-Ketoglutarat + NADPH+H+ + CO2 (mitochondrial matrix) Cankaya, M. Et al., 2007, BMC Genomics KIRMIZI : KUVVETLİ EKSPRESYON SARI : ORTA EKSPRESYON BEYAZ :ZAYIF EKSPRESYON MAVİ : EKSPRESYON YOK Cankaya, M. Et al., 2007, BMC Genomics KIRMIZI : KUVVETLİ EKSPRESYON SARI : ORTA EKSPRESYON BEYAZ :ZAYIF EKSPRESYON Cankaya, M. Et al., 2007, BMC Genomics MAVİ : EKSPRESYON YOK Fare genomu içinde bulunan çalışılan lipid ve amino asit enzim genleri http://www.genome.ad.jp web sayfasından bakılarak belirlenmiştir. Web sayfası açıldıktan sonra “KEGG PATHWAY” butonuna basıldı. http://www.genome.ad.jp/kegg/pathway.html web sayfası açıldı. Bu sayfadan ilgili metabolik yol seçildi. Database’de bulunan bütün organizmalara ait ortak pathway göründü. Daha sonra “Pathway menü”den “Mus musculus (mouse)” seçildi, “Go” tuşuna basıldı. Fareye ait genler yeşil kutucuklar içinde ekranda görüldü. Proje kapsamına alınan metabolik yollar aşağıdaki şekilde verilmiştir. GLUTAMAT METABOLİZMASI N-Acetyl-D-glucosamine Nagk -Glucosamine 6-phosphate Gfpt1 N-Acetyl-Dglucosamine 6phosphate Gnpnat1 Ppat 5-Phosphoribosylamine Nadsyn1 NAD+ Gmps GMP L-Glutaminyl-tRNA (Gln) Qars Cad Glutamine Oxalo acetate Malate Carbamoylphosphate Citrate Cps1 Glul Gls1 Fumarate NH3 Gls2 Succinate 2- oxoglutarate Gclc Gclm Glud1 1-pyrroline-5carboxylate Aldh4a1 L-glutamate Gamma-L-Glutamyl-L-cysteine Aldh5a1 Gpt1 Gpt2 Got1 Got2 Gss Glutathione (GSH) Gsr Gad1 succinate-semialdehyde Abat Gad2 Glutathione disulfide (GSSH) 4-Aminobutanoate Ears Eprs L-Glutamyl-tRNA (Glu) GLUTAMAT METABOLİZMASININ BÜTÜN GENLERİ İÇİN 12,5, 14,5, 15,5 GÜNLÜK FARE EMBRİYONİK DÖNEMLERİ VE POSTNATAL FARE BEYNİNDE (P56) EKSPRESYON YORUMLARI KARŞILAŞTIRMASI ENZİM ADI VE GEN SİMGESİ E12.5 E14.5 E15.5 P56 Glutamat piruvat transaminaz 1, soluble (Gpt1) Ekspresyon olmadı. Zayıf olarak yaygın ve genel olarak tüm dokularda ekspresyon olmuştur. Zayıf olarak yaygın ve genel olarak tüm dokularda ekspresyon olmuştur. Zayıf ve yaygın bir ekspresyonla beraber kortekste, serebellumda ekspresyon olduğu görüldü. Glutamat piruvat transaminaz (alanin aminotransferaz) 2 (Gpt2) Arka beyin boşluklarının yüzeyinde ve spinal kord da ekspresyon oldu. Beyin boşluklarında ekspresyon olmuştur. Beyin boşluklarında ekspresyon olmuştur. Zayıf ve yaygın bir ekspresyonla beraber kortekste, serebellumda ekspresyon görüldü. Glutamat dehidrogenaz 1 (Glud1) Karaciğerde çok kuvvetli ve belirgin olarak diğer dokularda da zayıf olarak ekspresyon olduğu görüldü. Kaslar, karaciğer, böbrekde çok daha belirgin olmak üzere tüm dokularda ekspresyon olmuştur Kaslar, karaciğer, böbrekde çok daha belirgin olmak üzere tüm dokularda ekspresyon olmuştur Talamus, hipotalamus ve serebellum başta olmak üzere kuvvetli ve yaygın bir ekspresyon olduğu belirlendi ENZİM ADI VE GEN SİMGESİ Glutamat okzaloasetat transaminaz 1, soluble (Got1) Glutamat okzaloasetat transaminaz 2, mitokondrial (Got2) E12.5 Karaciğer, akciğer, dorsal kök bezleri, böbrek, timusda ekspresyon oldu. Karaciğer, dorsal kök bezleri başta olmak üzere yaygın bir ekspresyon olduğu görüldü. E14.5 Yaygın ve genel olarak tüm dokularda ekspresyon olmuştur. Yaygın ve genel olarak tüm dokularda ekspresyon oldu. E15.5 P56 Yaygın ve genel olarak tüm dokularda ekspresyon olmuştur. Olfaktori soğancığı, talamus, hipotalamus ve serebellum başta olmak üzere kuvvetli ve yaygın bir ekspresyon olduğu belirlendi. Yaygın ve genel olarak tüm dokularda ekspresyon oldu. Olfaktori soğancığı, talamus, hipotalamus ve serebellum başta olmak üzere kuvvetli ve yaygın bir ekspresyon olduğu belirlendi. Noradrenalin Biyosentezi Noradrenaline 3 boyutlu olarak bu olaylar nasıl meydana gelir? Beyinde noradrenerjik projeksion şebekesi locus coeruleus rodent beyin sinir fiberi Solute Carrier Transporters (Slc) Exchanger Pasif transporter Coupled transporters nucleus vesicular transporter mitokondrial transporter Slc’ler inter ve intraselüler transporta aracılık ederler. BASAMAK 1: Fenilalanin karaciğerde tirozine çevrilir. Fenilalanin hidroksilaz BASAMAK 2: Slc3a2 Tirozin karaciğerden göç eder, ve choroid pleksus veya kan-beyin bariyeri vasıtasıyla beyine girer. choroid plexus Slc7a5 liver Slc16a10 uniporter Karaciğer: Slc ve bir enzim arasındaki birlikteliğe bir örnek heterodimerik antiporter BASAMAK 3: Tirozin locus coeruleus’a girer, fakat transporteri bilinmemektedir. Muhtemelen orphan Slc10a4’dür. locus coeruleus Slc10a4 BASAMAK 4: Tirozin L-Dopa’ya dönüşür. locus coeruleus Tirozin hidroksilaz BASAMAK 5: L-Dopa dopamine Dönüştürülür. locus coeruleus Dopa dekarboksilaz BASAMAK 6: Dopamin noradrenaline dönüştürülür. Noradrenaline locus coeruleus Dopamine beta hydroxylase BASAMAK 7: Noradrenerjik bir durum çıkarsa, veziküler noradrenalin transporter Slc18a2, sinapslara yerleşir. locus coeruleus Slc18a2 Noradarenalin ve ön maddelerinin sentezi ve transportu, üç boyutlu olarak organize edilmektedir. Solut taşıyıcı transporterler ve ilgili enzimler koekspresyona uğramaktadır. Küçük moleküllerin hareketini böylece üç boyutlu olarak takip edebiliriz. Çünkü onların transport yerleri ve ilgili enzimlerin ekspresyon haritalarına sahibiz. Böylece solut taşıyıcı transporterler ve enzimlerin ekspresyon örnekleri, metabolik pathway’lerin 3 boyutlu yerlerini haritalandırmak için kullanılabilir. KOLESTEROL SENTEZİ METABOLİZMASI Kolesterol ve onun biyosentetik yolağı ara ürünleri ve türevleri membran biogenezi, transmembran reseptör sinyalizasyonu, steroid aktivasyonu ve hedgehog (Hh) proteinlerinin birçok gelişimsel proses için gereklidir. biogenezi, nükleer reseptör posttranslasyonel modifikasyonu gibi Şişecioğlu, M. et al. Journal of Lipid Research, 2015 Şişecioğlu, M. et al. Journal of Lipid Research, 2015 Bu çalışmada, ilk kez bütün bir organizma için, asetil-CoA’dan başlayıp kolesterol ile biten kolesterol biyosentezinde (CBS) gerekli olan tüm genlerin 3D ekspresyon profilleri- modelleri belirlendi. Şişecioğlu, M. et al. Journal of Lipid Research, 2015 Expression of CBEs in the developing forebrain Şişecioğlu, M. et al. Journal of Lipid Research, 2015 Expression of CBEs in the developing eye. Şişecioğlu, M. et al. Journal of Lipid Research, 2015 Expression domains of Hmgcr and Shh in the E13.5 mouse embryo The ventricular zone of the hypothalamicarea (A), the mesencephalic area (B), and the vibrissae follicles (C) Bu çalışma aynı zamanda CBS ve Shh ekspresyon bölgelerinin uzaysal-mekansal ilişkisini de açıklamaktadır (CBS’nin düzenleyici enzimi olan Hmgcr seçilmiştir). Şişecioğlu, M. et al. Journal of Lipid Research, 2015 * Kolesterol biyosentezi (CBS) için gerekli olan tüm genlerin 3D ekspresyon profilleri fare fetüsünden alınan seri kesitlerde in situ hibridizasyon yöntemiyle modelleri belirlendi. Annotasyon görüntü verileri METscout ve GenePaint veritabanlarına aktarıldı. *Bu yeni bilgiler kolesterol biyosentezi enzimlerinin (CBE) neden fetusun içinde belirli bölgelerinde spesifik ekspresyona uğradığını anlamamıza yardımcı olacaktır. Örnek olarak, embriyonik gelişimde önemli fonksiyonu olan sonic Hh (Shh) proteinleri ile kolesterol biyosentezi enzimlerinin ekspresyon profillerinin paralellik göstermesi ve birbiriyle ilişkili olması gibi. *Nöron aksonlarının oluşması ve sinapsların şekillenmesi gibi proseslerde hücre proliferasyonunun ve proliferasyonun gerçekleştiği yerlerdeki membranın yüzeyinin arttığı bölgelerde güçlü CBE ekspresyonu gözlemlendi. TEŞEKKÜR Bu çalışmalar; • Avrupa Birliği Çerçeve Programı, • TÜBİTAK • Kalkınma Bakanlığı tarafından desteklenmiştir. Dinlediğiniz için teşekkürler!..