106-115 Metisiline - Hastane Infeksiyonlari Dergisi
Transkript
106-115 Metisiline - Hastane Infeksiyonlari Dergisi
Hastane ‹nfeksiyonlar› Dergisi 1997; 1: 106-115 tan H as e f İn ek si yonları Metisiline Dirençli Staphylococcus aureus’un Kantitatif Antibiyogram ve “Arbitrarily Primed” PCR (AP-PCR) Yöntemleriyle Epidemiyolojik Sürveyans› Dr. Metin OTKUN*, Dr. Filiz AKATA*, Dr. Sesin KOCAGÖZ**, Dr. Müflerref TATMAN-OTKUN*, Dr. Yeflim ÇET‹NKAYA**, Dr. Bahri TEKER* Dr. Volkan DÜNDAR*, Dr. Serhat ÜNAL** * Trakya Üniversitesi T›p Fakültesi, Klinik Bakteriyoloji ve ‹nfeksiyon Hastal›klar› Anabilim Dal›, Edirne. ** Hacettepe Üniversitesi T›p Fakültesi, ‹ç Hastal›klar› Anabilim Dal› ‹nfeksiyon Hastal›klar› Ünitesi, Ankara. ÖZET Metisiline dirençli Staphylococcus aureus (MRSA) infeksiyonlar› ciddi ve tedavisi güç infeksiyonlard›r. MRSA salg›nlar›n›n epidemiyolojisini incelemek ve nozokomiyal yay›l›m yollar›n› tan›mlamak için bireysel MRSA kökenlerinin ay›rt edilebilmesi gerekir. Bu çal›flman›n amac› kantitatif antibiyogram yöntemini kullanarak MRSA sürveyans›n› sa¤lamak ve sonuçlar›n› AP-PCR ile karfl›laflt›rarak yinelenebilirlik, ay›rt edici güç ve epidemiyolojik aç›dan de¤erini incelemektir. Ekim 1994 - May›s 1996 döneminde 26 hastadan 33 MRSA izole edilmifltir. Kantitatif antibiyogram tipleme 33 izolat› alt› gruba ay›rm›flt›r. Bunlardan birincisinde 27 izolat yer al›rken, birinde iki ve dördünde birer izolat bulunmaktad›r. AP-PCR ise MRSA izolatlar›n› dört gruba ay›rm›flt›r. Bu gruplardan birincisinde 31 izolat yer al›rken, üç izolat farkl› amplifikasyon bantlar› vermifltir. Epidemiyolojik veriler ile birlikte de¤erlendirildi¤inde her iki yöntemin de ay›rt edici gücü s›n›rl› bulunmufl, sonuçlar›n birlikte de¤erlendirilmesi halinde daha yüksek ay›rt edici güç sa¤lanm›flt›r. Sonuç olarak de¤iflik kökenlerin araya girmesine karfl›n bir özel klonun Trakya Üniversitesi T›p Fakültesi hastanemizde zaman içinde endemik hale geldi¤i saptanm›flt›r. 106 Anahtar Kelimeler: MRSA, Sürveyans, Tipleme, Kantitatif Antibiyogram, AP-PCR SUMMARY Epidemiological Surveillance of Methicillin - Resistant Staphylococcus aureus by Quantitative Antibiogram and Arbitrarily Primed PCR (AP-PCR) Typing Methods The methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) infections are serious and difficult to treat. Epidemiologic investigation of MRSA infections and identification of modes of nosocomial MRSA transmission require the ability to distinguish individual strains. The purpose of this study was to follow the MRSA surveillance by using quantitative antibiogram and to analyze its reproducibility, discriminatory power and epidemiological value by comparing the results with AP-PCR. Thirty three MRSA isolates were obtained from 26 patients between October 1994 and May 1996. Quantitative antibiogram typing classified these isolates into six distinct groups. One of these groups included 27 MRSA isolates and one of the others included two MRSA isolates. The remaining four MRSA isolates were found to be different from each other and classified into four seperate groups. By AP-PCR four groups were discriminated among these isolates. Thirty-one of the isolates were in one group and the remaining two MRSA isolates were classified into distinct groups. Discriminatory power of both methods were found to be limited when the results were evaluated in accordance with epidemiological data. On the other hand, discriminatory power was more enhanced if the results of AP-PCR and quantitative antibiogram typing were evaluated together. It was concluded that although several different MRSA strains were involved, a special clone has become endemic in Trakya University Hospital. Key Words: MRSA, Surveillance, Typing, Quantitative Antibiogram, AP-PCR Hastane ‹nfeksiyonlar› Dergisi 1997; 1: 2 Metisiline Dirençli Staphylococcus aureus’un Kantitatif Antibiyogram ve “Arbitrarily Primed” PCR (AP-PCR) Yöntemleriyle Epidemiyolojik Sürveyans› G‹R‹fi Metisiline dirençli Staphylococcus aureus (MRSA) ilk olarak 35 y›l önce tan›mlanm›flt›r (1) ve halen tüm dünyada hastaneden kazan›lm›fl infeksiyonlar›n önemli ve gittikçe artan bir etkenidir (2). Türkiye’de S. aureus izolatlar›nda metisilin direnci %25-40 aras›nda de¤iflmektedir (3-7). MRSA salg›nlar›n›n epidemiyolojisini incelemek ve nozokomiyal MRSA yay›l›m›n›n yollar›n› tan›mlamak için bireysel MRSA kökenlerinin ay›rt edilebilmesi gerekir (8). Hastane içinde S. aureus’un klonal yay›lma e¤ilimi klinik izolatlarda özgül tipleme yöntemlerinin gelifltirilmesine yol açm›flt›r. Ancak MRSA kökenleri aras›nda yüksek derecedeki genetik yak›nl›k (9) nedeniyle özellikle rutin bakteriyolojik yöntemleri kullanan pek çok hastane laboratuvar› için bu ayr›m güç olabilir. K›sa bir süre önce Tenover ve arkadafllar› 12 de¤iflik tipleme yöntemini karfl›laflt›rm›fllar ve epidemiyolojik çal›flmalar için DNA kaynakl› tiplemelerin daha uygun oldu¤unu, ama karfl›laflt›rd›klar› hiç bir yöntemin tek bafl›na, ba¤lant›s›z kökenleri epidemiyolojik olarak ba¤lant›l› kökenlerden aç›k bir flekilde ay›rt etmeye yetmedi¤ini belirtmifllerdir (10). Antimikrobiyal duyarl›l›k testleri bu amaçla s›k kullan›lan yöntemlerden biridir. Ancak MRSA’lar›n büyük bir k›sm› benzer flekilde ço¤ul antibiyotik dirençli olduklar›ndan bu yöntemin araflt›rmalardaki yarar› s›n›rl›d›r (11). Antimikrobiyal duyarl›l›k testleri ile tiplemenin do¤al bir zay›fl›¤› bu duyarl›l›¤›n s›kl›kla çevresel faktörler veya plazmidlerle de¤iflebilmesidir (12). Sürveyans çal›flmalar›nda yöntemin de¤erini artt›rabilmek için Giacca ve arkadafllar› disk diffüzyon testlerinde ölçülen inhibisyon zon çaplar›n› kullanarak yap›lan bir benzerlik analizi önermifllerdir (13). Blanc ve arkadafllar› kantitatif antibiyogram diye isimlendirilebilecek bu yöntemi MRSA sürveyans›nda kullanm›fllar, karmafl›k ve pahal› moleküler tipleme yöntemlerine ulafl›lamayan durumlarda basit ve güvenilir bir yöntem oldu¤unu ileri sürmüfllerdir (14). Bu çal›flman›n amac› bir üniversite hastanesinde 20 ayl›k bir dönem içinde kantitatif antibiyogram yöntemini kullanarak MRSA sürveyans›n› sa¤lamak ve sonuçlar›n› iyi tan›mlanm›fl moleküler bir tipleme yöntemi olan “Arbitrarily primed” PCR (AP-PCR) ile karfl›laflt›rarak yinelenebilirlik, Hastane ‹nfeksiyonlar› Dergisi 1997; 1: 2 Otkun M, Akata F, Kocagöz S, Tatman-Otkun M, Çetinkaya Y, Teker B, Dündar V, Ünal S. ay›rt edici güç ve epidemiyolojik aç›dan de¤erini incelemektir. MATERYAL ve METOD Hastanenin özellikleri ve çal›flma dönemi: Trakya Üniversitesi Hastanesi (TÜH) 400 yatakl›, üçüncü basamak bir e¤itim hastanesidir. Hizmet etti¤i nüfus yaklafl›k 400.000’dir ve y›lda yaklafl›k 10.000 hasta hastaneye yat›r›lmaktad›r. TÜH’de dört yatakl› bir “merkezi yo¤un bak›m” birimi bulunmakta olup S. aureus izolatlar›nda metisilin direnci s›kl›¤› 1995 y›l› içinde %48 olarak bulunmufltur (15). Bu çal›flmaya Ekim 1994 - May›s 1996 aras› klinik kültürlerinde MRSA üretilen tüm hastalar al›nm›flt›r. Epidemiyoloji Çal›flmaya al›nan her hastadan TÜH ‹nfeksiyon Kontrol Ekibi taraf›ndan flu veriler toplanm›flt›r: demografik veriler, ikamet yeri, baflvuru ve ç›k›fl tarihleri, yat›r›ld›¤› servis ve hastane içinde varsa di¤er servislere nakli, daha önceki yat›fllar, tan›, bakteriyoloji sonuçlar› ve infeksiyon kontrol önlemleri. Olgular yatt›klar› serviste ayn› antibiyotip ile infekte baflka bir hasta ile ayn› dönemde yatm›fllar ise epidemiyolojik olarak ba¤lant›l› kabul edilmifl, epidemiyolojik ba¤lant› kurulamayan olgular sporadik olarak nitelendirilmifllerdir. Ayn› serviste MRSA’l› baflka bir hasta yok iken yat›fl›n ilk 48 saati içinde izole edilen MRSA hastane d›fl› kökenli olarak düflünülmüfltür. Çal›flman›n ikincil bir amac› da tipleme yöntemlerinin özgüllük ve duyarl›l›klar›n› de¤erlendirmek oldu¤undan ayn› hastadan izole edilen birden fazla MRSA çal›flmaya al›nm›flt›r. Mikrobiyoloji S. aureus izolatlar› Gram boyama, katalaz, koagülaz ve DNaz testleri ile tan›mlanm›flt›r (16). Metisilin direnci 1 µg oksasilin diski, agar tarama (screen) (17) ve modifiye agar yayma (spread) (18) testleri ile araflt›r›lm›flt›r. Oksasilinin minimal inhibitör konsantrasyon (M‹K) de¤erleri mikrodilüsyon yöntemiyle NCCLS önerileri do¤rultusunda saptanm›flt›r (17). Metisiline dirençli oldu¤u yukar›da belirtilen metodlarla do¤rulanan izolatlarda Ünal ve arkadafllar› taraf›ndan tan›mlanan yöntem kullan›larak PCR ile mecA geni araflt›r›lm›flt›r (19). 107 Otkun M, Akata F, Kocagöz S, Tatman-Otkun M, Çetinkaya Y, Teker B, Dündar V, Ünal S. Kantitatif antibiyogram tipleme Antimikrobiyal duyarl›l›k testleri Müller-Hinton agar ve standart antimikrobik diskler (Difco Laboratories, ABD) kullanarak NCCLS önerilerine göre disk diffüzyon testi ile yap›lm›flt›r (20). Çal›fl›lan antimikrobikler: eritromisin, klindamisin, kotrimoksazol, gentamisin ve rifampisindir. Bu antimikrobiklerin seçilmelerinin nedenleri: (i) MRSA izolatlar›nda de¤iflik ve ba¤›ms›z direnç mekanizmalar›n›n olmas› ve/veya, (ii) Direncin kromozomal olmas› ve/veya, (iii) Hastanemizde nispeten az kullan›lmalar›d›r. Kantitatif antibiyogram tipleme disk diffüzyon testlerinde elde edilen inhibisyon zon çaplar›n›n benzerlik analizi yöntemiyle yap›lm›flt›r (14). Benzerlik katsay›s› olarak Euclid aral›¤› kullan›lm›flt›r; iki MRSA aras›ndaki fark her bir antimikrobik için karfl›laflt›r›lan iki izolat›n inhibisyon zon çaplar› aras›ndaki farklar›n kareleri toplam›n›n kareköküdür. ‹ki organizma aras›ndaki fark büyüdükçe benzerlik azalmaktad›r. Bu formül her bir izolat›n di¤er bütün izolatlar ile yak›nl›k derecesini saptamak için hesaplanm›flt›r. Ayn› kökenin farkl› zamanlarda antibiyogram› tekrar yap›ld›¤›nda belli bir de¤iflkenlik görülebilece¤inden tüm izolatlarda farkl› zamanlarda iki kez disk difüzyon duyarl›l›k testi yap›lm›flt›r. Her bir mikroorganizma için iki test aras›ndaki Euclid aral›klar›na göre bir s›n›r de¤er seçilmifltir. Seçilen s›n›r de¤er ilk ve ikinci test sonuçlar› aras›ndaki Euclid aral›klar›n›n en az %95’inden büyük olan de¤erdir. Bu yüzden yöntemin yinelenebilirli¤i en az %95’tir. ‹ki ayr› izolat aras›ndaki Euclid aral›¤› s›n›r de¤erden düflükse kantitatif antibiyogram tipleme yönteminde izolatlar ba¤lant›l› olarak nitelendirilmifltir. Daha sonra a¤›rl›ks›z olarak çiftleri gruplama yoluyla küme analizi yap›lm›fl ve buna göre bir dendrogram çizilmifltir. Hesaplamalarda ve dendrogram çiziminde SPSS for Windows (Release 6.1, SPSS Inc., 1994) bilgisayar program› kullan›lm›flt›r. Disk diffüzyon testlerinde kalite kontrol amac›yla standart sufl olarak Escherichia coli ATCC 25922 ve S. aureus ATCC 25923 kullan›lm›flt›r. Arbitrarily Primed PCR (AP-PCR) Bakteri DNA’s›n›n haz›rlanmas›nda Ünal ve arkadafllar› taraf›ndan stafilokoklar için tan›mlanm›fl olan h›zl› lizis protokolü modifiye edilerek 108 Metisiline Dirençli Staphylococcus aureus’un Kantitatif Antibiyogram ve “Arbitrarily Primed” PCR (AP-PCR) Yöntemleriyle Epidemiyolojik Sürveyans› kullan›lm›flt›r (19). ‹fllem öncesinde tüm MRSA izolatlar›n›n Mueller-Hinton s›v› besiyerine ekimi yap›lm›flt›r. 35°C’da bir gecelik inkübasyonu takiben 5000 rpm’de 20 dakikal›k santrifüjle bakterilerin çökmesi sa¤lanm›fl ve üst s›v› uzaklaflt›r›lm›flt›r. Bakteri çökelekleri steril koflullarda ependorf tüplere aktar›lm›fl ve 14000 rpm’de 5 dakika daha santrifüj edilmifltir. Üst s›v› uzaklaflt›r›ld›ktan sonra kalan bakteri çökele¤inin üzerine 50 µL lizostafin (100 µg/mL, Sigma Chemical Co., St.Louis, Mo.) eklenip 5 dakika 37°C’da su banyosunda tutulmufltur. Daha sonra bu süspansiyonun üzerine 50 µL proteinaz K (100 µg/mL, Sigma Chemical Co., St.Louis, Mo.) eklenmifl ve 5 dakika daha 37°C’de bekletilmifltir. Tüpler kaynar su içinde 15 dakika kaynat›ld›ktan sonra 1 dakika 14000 rpm’de santrifüj edilmifl ve üst s›v› yeni bir ependorf tüpe aktar›larak -20°C’de saklanm›flt›r. Elde edilmifl olan bu bakteri DNA süspansiyonunun 1 µL’si 50 µL PCR kar›fl›m› içinde amplifikasyona al›nm›flt›r. Amplifikasyonlarda Mycobacterium tuberculosis’e özgül primerler (5’ CCTGTGGGGTCCGGGCTTTC 3’, 5’ GATCTGCGGGTCGTCCCAGGT 3’) kullan›lm›flt›r. Her tüpte 50 mM KCl, 10 mM TrisHCl (pH 8.3), %0.1 TritonX-100, 2.5 mM MgCl2, her dNTP’den 0.2 mM, 1 ünite taq polimeraz enzimi Epicentre) ve 50 pmol primer olacak flekilde reaksiyon kar›fl›mlar› haz›rlanm›flt›r. DNA amplifikasyonlar› (Stuart, EC) üretici firman›n önerileri do¤rultusunda flu parametreler kullan›larak gerçeklefltirilmifltir: • “Low-stringency” sikluslar (3 siklus): Denatürasyon 94°C 1 dakika Birleflme 30°C 1 dakika Uzama 72°C 1 dakika • “High-stringency” sikluslar (45 siklus) Denatürasyon 94°C 1 dakika Birleflme 55°C 1 dakika Uzama 72°C 1 dakika Elde edilen amplifikasyon ürünlerinin 10 µL’si, %2’lik agaroz jelde yürütülerek ultraviolet transillüminatör üzerinde incelenerek foto¤raflar› çekilmifltir (21,22). AP-PCR çal›fl›l›rken bir adet metisiline duyarl› S. aureus (MSSA) ve bir adet metisiline dirençli S. epidermidis (MRSE) kökeni kontrol amac›yla di¤er izolatlarla birlikte çal›fl›lm›flt›r. Hastane ‹nfeksiyonlar› Dergisi 1997; 1: 2 Metisiline Dirençli Staphylococcus aureus’un Kantitatif Antibiyogram ve “Arbitrarily Primed” PCR (AP-PCR) Yöntemleriyle Epidemiyolojik Sürveyans› SONUÇLAR TÜH’de Ekim 1994 - May›s 1996 döneminde 26 hastadan 33 MRSA izole edilmifltir. Bu hastalar›n 8’i kad›n, 18’i erkek olup yafl ortalamalar› 44.4 ± 16.6 (13-46-70) (ortalama ± standart sapma (minimum - median - maksimum)’d›r. Hastalar›n 7’si merkez yo¤un bak›m ünitesi 6’s› ortopedi, 4’ü iç hastal›klar›, 2’si beyin cerrahisi ve birer tanesi gö¤üs hastal›klar›, nöroloji, üroloji, gö¤üskalp-damar cerrahisi, koroner yo¤un bak›m ve genel cerrahi servislerinde yatm›flt›r. Multipl miyelom tan›l› bir hasta ise acil servise baflvurdu¤unda istenen idrar kültüründe MRSA üremifltir. Ancak bu hastan›n di¤er bilgilerine ulafl›lamam›flt›r. Servis hastalar›n›n yat›r›lma nedenleri 8’inde travmaya ba¤l› kemik k›r›klar›, 3’ünde serebrovasküler hastal›k, 3’ünde kronik böbrek yetmezli¤i, üçünde malignite, birer hastada ise ateflli silah yaralanmas›, Guillain-Barré sendromu, gazl› gangren, korozif madde içilmesi, tüberküloz ampiyem, kalp yetmezli¤i, akut arteriyel tromboz ve postoperatif pnömotorakst›r. Hastalar›n 12’sinde operasyon öyküsü al›nm›fl ve 23’ü MRSA’n›n saptanmas›ndan önce antibiyotik kullanm›flt›r. En s›k kullan›lan antibiyotikler 14 hastada 2. veya 3. kuflak sefalosporin, 10 hastada imipenem ve 8 hastada aminoglikozitlerdir. MRSA kolonizasyonu ve infeksiyonunu kolaylaflt›racak risk faktörü olarak 10 hastada nazogastrik sonda, 16 hastada idrar sondas›, 6 hastada kemik-eklem protezi veya ortopedik çivi, 5 hastada damar içi kateter bulunmufltur. Bu hastalar›n yat›fl, ç›k›fl ve MRSA üremesinin saptand›¤› tarihler fiekil 1’de gösterilmifltir. MRSA izolatlar›n›n 20’si (%61) eritromisine, 30’u (%91) klindamisine, 2’si (%6) kotrimoksazole, 30’u (%91) gentamisine ve 29’u (%88) rifampisine dirençlidir. Bu izolatlar›n izole edildikleri infeksiyon yerleri, tarihleri ve servisleri, çal›fl›lan antimikrobik diskleri çevresindeki inhibisyon zon çaplar›, oksasilin minimal inhibisyon konsantrasyon (M‹K) de¤erleri ve mecA geni sonuçlar› Tablo 1’de gösterilmifltir. ‹zolat 5, 7 ve 9, izolat 20 ve 21, izolat 17, 19, 22 ve 26, izolat 29 ve 30 ayn› hastalardan izole edilmifl gruplard›r. Tüm izolatlar›n iki kez tekrarlanan antimikrobiyal duyarl›l›klar› sonuçlar›na göre elde edilen en büyük Euclid aral›¤› 11.5’tir ve 33 izolat›n 32’sinde bu de¤er 8.0’den küçük bulunmufltur. Bu nedenle s›n›r de¤er 8.0 olarak seçilmifltir. Yöntemimizin yinelenebilirli¤i %97.0 (32/33)’dir. Hastane ‹nfeksiyonlar› Dergisi 1997; 1: 2 Otkun M, Akata F, Kocagöz S, Tatman-Otkun M, Çetinkaya Y, Teker B, Dündar V, Ünal S. Sonuçta izolatlar aras›ndaki fark 8.0’den küçükse ba¤lant›l› kabul edilmifltir. Kantitatif antibiyogram tiplemeye dayanan dendrogram 33 izolat› alt› gruba ay›rm›flt›r. Bunlardan birincisinde 27 izolat yer al›rken, birinde iki ve dördünde birer izolat bulunmaktad›r (fiekil 2). AP-PCR yöntemi ise MRSA izolatlar›n› dört gruba ay›rm›flt›r. Bu gruplardan birincisinde 31 izolat yer al›rken izolat 10, 14 ve 16 farkl› bant paterni vermifltir (fiekil 3). Bunlardan izolat 10 ve 16 kantitatif antibiyogram ile de farkl› bulunurken izolat 14 kantitatif antibiyogram ile ay›rt edilememifltir. Buna karfl›n kantitatif antibiyogram, AP-PCR taraf›ndan büyük grupta olarak nitelendirilen izolat 1, 4, 2 ve 15’i ayr› tipler halinde ay›rt etmifl ve izolat 2 ile 15’i bir gruba sokmufltur. Ayn› hastadan izole edilen izolatlar her iki yöntemle de ba¤lant›l› bulunmufltur. Kontrol amac›yla çal›fl›lan MSSA ve MRSE kökenleri APPCR taraf›ndan di¤er izolatlardan ay›rt edilebilmifltir. Her iki yöntemin s›n›fland›rma sonuçlar› yine Tablo 1’de sunulmufltur. Hem kantitatif antibiyogram, hem de AP-PCR ile di¤erlerinden ayr›lan 16 no’lu izolat 256 µg/mL’nin üstünde bulunan oksasilin M‹K de¤erine karfl›n mecA geni negatif olarak saptanm›flt›r. TARTIfiMA MRSA infeksiyonlar› ciddi ve tedavisi güç infeksiyonlard›r. Bu infeksiyonlar›n tedavisi için çok az antimikrobik seçene¤i vard›r ve bunlar›n hiçbiri de ideal özellikleri tafl›maz. Bu infeksiyonlar›n korunmas›nda bakterinin kaynaklar›n› saptamak ve yok etmek veya hastaya bulafl yollar›n› kesmek, böylece MRSA infeksiyonlar›n›n say›s›n› azaltmak önemli bir amaçt›r. Hangi kökenin, hangi kaynaktan ve hangi yollarla di¤er hastalara yay›ld›¤›n› saptayabilmek için kökenleri tiplendirerek tek tek ay›rt edebilmek gerekir (22). MRSA tiplendirilmesinde fenotipik ya da genotipik özellikleri temel alan pek çok çal›flma yap›lm›flt›r, ama amaca tam anlam› ile uyan ideal bir tipleme yöntemi bu güne kadar tan›mlanamam›flt›r (23). MRSA tiplendirilmesinde kullan›lan çeflitli yöntemleri karfl›laflt›ran en genifl çal›flmada hiç bir yöntemin di¤erlerine tam anlam›yla üstünlük sa¤layamad›¤›, yöntemleri kombine etmenin daha iyi sonuç verece¤i ve bu nedenle her laboratuvar›n iki tipleme yöntemini rutin olarak kullanmas› gerekti¤i sonucuna ulafl›lm›flt›r 109 Metisiline Dirençli Staphylococcus aureus’un Kantitatif Antibiyogram ve “Arbitrarily Primed” PCR (AP-PCR) Yöntemleriyle Epidemiyolojik Sürveyans› MYBÜ (18) MYBÜ (32) Cerrahi (33) GKDC (31) MYBÜ (27) Ortopedi (28) MYBÜ (29,30) ‹ç hastal›klar› (20,21) Ortopedi (23) MYBÜ (24) Acil (14)* Beyin cerrahi (17,19,22,26) MYBÜ (13) MYBÜ (12) Ekim 1994 ‹ç hastal›klar› (8) Ortopedi (6) Ortopedi (3) Antibiyotip 1 Koroner (2) Antibiyotip 2 Antibiyotip 3 Antibiyotip 4 ‹ç hastal›klar› (1) Beyin cerrahisi (4) Antibiyotip 5 Antibiyotip 6 Ortopedi (11) Ortopedi (5,7,9) Üroloji (10)* ‹ç hastal›klar› (16)* Gö¤üs hastal›klar› (15) Nöroloji (25) May›s 1996 Otkun M, Akata F, Kocagöz S, Tatman-Otkun M, Çetinkaya Y, Teker B, Dündar V, Ünal S. fiekil 1. MRSA izole edilen hastalar›n yat›fl tarihleri ve servisleri. (Gri renkli çubuklar yat›fl dönemlerini, dikine siyah çizgiler MRSA izolasyon tarihlerini göstermektedir. Parantez içindeki numaralar izolat no’sudur. MYBÜ: merkez yo¤un bak›m ünitesi; GDKC: gö¤üs-kalp-damar cerrahisi; *: AP-PCR taraf›ndan ay›rt edilen izolatlar). 110 Hastane ‹nfeksiyonlar› Dergisi 1997; 1: 2 Metisiline Dirençli Staphylococcus aureus’un Kantitatif Antibiyogram ve “Arbitrarily Primed” PCR (AP-PCR) Yöntemleriyle Epidemiyolojik Sürveyans› Otkun M, Akata F, Kocagöz S, Tatman-Otkun M, Çetinkaya Y, Teker B, Dündar V, Ünal S. Tablo 1. MRSA ‹zolatlar›n›n Mikrobiyolojik ve Epidemiyolojik Özellikleri. ‹zolat Tarih ‹nfeksiyon yeri Servis CC SXT E GM RA OXA MecA Antibiyotip AP-PCR No tip 1 04.10.94 Yumuflak doku ‹ç hastal›klar› 23 28 24 21 30 256 + 3 A 2 07.10.94 Kan Koroner 6 28 6 8 6 >256 + 2 A 3 12.10.94 Cerrahi yara Ortopedi 26 26 17 8 6 >256 + 1 A 4 03.11.94 Cerrahi yara Beyin cerrahisi 6 6 6 26 35 >256 + 5 A 5 05.12.94 Cerrahi yara Ortopedi 28 26 12 9 6 >256 + 1 A 6 08.12.94 Cerrahi yara Ortopedi 30 28 13 7 6 >256 + 1 A 7 06.03.95 Cerrahi yara Ortopedi 29 26 11 8 7 >256 + 1 A 8 13.04.95 Kateter yeri ‹ç hastal›klar› 29 25 12 7 6 256 + 1 A 9 19.04.95 Cerrahi yara Ortopedi 25 27 13 7 6 Ç Ç 1 - 10 05.06.95 ‹drar Üroloji 31 6 9 6 38 >256 + 6 C 11 07.08.95 Cerrahi yara Ortopedi 31 28 14 8 6 >256 + 1 A 12 11.08.95 Trakeal aspirat MYBÜ 29 26 12 8 6 256 + 1 A 13 09.09.95 Kan MYBÜ 30 25 14 8 6 >256 + 1 A 14 24.09.95 ‹drar Acil servis 26 26 16 7 6 >256 + 1 B 15 10.10.95 Balgam Gö¤üs hast. 6 28 6 6 6 >256 + 2 A 16 11.10.95 Kateter yeri ‹ç hastal›klar› 18 31 6 30 35 >256 - 4 D 17 27.10.95 Trakeal aspirat Beyin cerrahisi 29 25 11 8 6 Ç Ç 1 - 18 05.11.95 Trakeal aspirat MYBÜ 28 25 16 7 6 Ç Ç 1 - 19 09.11.95 BOS Beyin cerrahisi 30 26 12 7 6 Ç Ç 1 - 20 13.11.95 Kan ‹ç hastal›klar› 30 25 15 7 9 Ç Ç 1 - 21 14.11.95 Kateter yeri ‹ç hastal›klar› 28 25 15 7 6 Ç Ç 1 - 22 14.11.95 Nöral doku Beyin cerrahisi 28 24 12 7 6 Ç Ç 1 - 23 26.01.96 Cerrahi yara Ortopedi 30 26 14 8 6 >256 + 1 A 24 20.02.96 Kan MYBÜ 30 25 15 8 6 >256 + 1 A 25 28.02.96 Trakeal aspirat Nöroloji 30 26 13 7 6 >256 + 1 A 26 14.03.96 Cerrahi yara Beyin cerrahisi 28 25 12 7 6 256 + 1 A 27 01.04.96 Trakeal aspirat MYBÜ 29 25 16 8 6 >256 + 1 A 28 20.04.96 Cerrahi yara Ortopedi 30 25 11 7 6 256 + 1 A 29 06.05.96 Kateter yeri MYBÜ 30 27 15 8 6 >256 + 1 A 30 06.05.96 Trakeal aspirat MYBÜ 28 24 13 8 6 >256 + 1 A 31 08.05.96 Cerrahi yara GKDC 26 24 12 9 6 >256 + 1 A 32 10.05.96 Trakeal aspirat MYBÜ 30 27 14 8 6 256 + 1 A 33 16.05.96 Cerrahi yara Genel cerrahi 31 26 13 8 6 >256 + 1 A CC: klindamisin, SXT: kotrimoksazol, E: eritromisin, GM: gentamisin, RA: rifampin, OXA: oksasilin, Ç: çal›fl›lmad›, MYBÜ: merkez yo¤un bak›m ünitesi, GKDC: gö¤üs-kalp-damar cerrahisi. Hastane ‹nfeksiyonlar› Dergisi 1997; 1: 2 111 Metisiline Dirençli Staphylococcus aureus’un Kantitatif Antibiyogram ve “Arbitrarily Primed” PCR (AP-PCR) Yöntemleriyle Epidemiyolojik Sürveyans› Otkun M, Akata F, Kocagöz S, Tatman-Otkun M, Çetinkaya Y, Teker B, Dündar V, Ünal S. Servis MYBÜ MYBÜ Ortopedi MYBÜ MYBÜ Beyin Cer. Nöroloji Genel Cer. Ortopedi Ortopedi Beyin Cer. Beyin Cer. ‹ç Hast. MYBÜ Ortopedi MYBÜ Beyin Cer. Ortopedi Ortopedi ‹ç Hast. Ortopedi Acil Servis MYBÜ ‹ç Hast. MYBÜ Ortopedi GTDC Koroner Gö¤üs Hast. ‹ç Hast. ‹ç Hast. Beyin Cer. Üroloji No + 29 32 23 13 24 19 25 33 6 11 22 26 8 30 5 12 17 28 7 20 3 14 18 21 27 9 31 2 15 1 16 4 10 8 : 10 : + 20 + 30 + 40 + 50 + : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : S›n›r de¤er fiekil 2. Befl adet antibiyotik diskinin çevresindeki inhibisyon zonlar›n›n Euclid aral›klar›na göre çizilen dendrogram›. (10). Seçilecek yöntemlerden biri epidemiyolojik bir çal›flmada ileri incelemeye al›nacak tüm olas› kökenleri saptayacak duyarl›l›kta ve di¤eri de daha sonra ayr›nt›l› köken farkl›l›¤›n› saptayacak özgüllükte olmal›d›r. Yöntemlerin seçilmesi laboratuvar›n kaynaklar›na ve personelinin teknik ustal›¤›na ba¤l›d›r. Maslow ve arkadafllar› tipleme sistemlerinin befl özelli¤ini tan›mlam›fllard›r (24). Bunlar tipleyebilme, yinelenebilme, ay›rt edici güç, yorum kolayl›¤› ve kullan›m kolayl›¤›d›r. Kökenleraras› farkl›l›¤› saptayabilmek için teknik ustal›k gereksinimi artt›kça genellikle bu ustal›¤› olmayan klinik mikrobiyologlarca yöntemi uygulama iste¤i düflmektedir (14). 112 Antimikrobiyal duyarl›l›k testleri haz›rlamas› ve yorumlamas› en kolay, en ucuz ve en h›zl› tipleme yöntemidir ve özellikle küçük laboratuvarlarda köken yak›nl›¤›n› incelemenin ilk yolu olarak nitelendirilir. Bu yöntem hastane ortam›na yeni ve farkl› bir MRSA kökeninin giriflini saptamada baflar›l› bir flekilde kullan›lm›flt›r (25). Ancak pek çok MRSA klonu benzer flekilde ço¤ul antibiyotik dirençli olduklar›, direncin plazmid kaynakl› olabilmesi ve hastane içinde kullan›lan antibiyotiklerin seçici bask›s› yüzünden ayn› anda farkl› kökenlerde direncin geliflmesi nedeni ile zay›f ay›rt edici güçte bulunur. Duyarl›, ara duyarl› ve dirençli fleklinde s›n›flama yorumlar› Hastane ‹nfeksiyonlar› Dergisi 1997; 1: 2 Metisiline Dirençli Staphylococcus aureus’un Kantitatif Antibiyogram ve “Arbitrarily Primed” PCR (AP-PCR) Yöntemleriyle Epidemiyolojik Sürveyans› Otkun M, Akata F, Kocagöz S, Tatman-Otkun M, Çetinkaya Y, Teker B, Dündar V, Ünal S. rumlanmal›d›r (12). Bu çal›flmada da ayn› (ayn› hastadan, ayn› günde ve ayn› yerden) veya yak›n ba¤lant›l› (ayn› hastadan farkl› gün veya yerden) olmas› gereken izolatlar birlikte çal›fl›larak yöntemlerin duyarl›l›k ve özgüllükleri incelenmifltir. Kulland›¤›m›z her iki yöntem de bu kökenleri ayn› tip olarak göstermesine karfl›n çal›fl›lan 33 izolat› kantitatif antibiyogram tipleme alt›, AP-PCR dört gruba ay›rm›flt›r. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 fiekil 3. AP-PCR yöntemi ile farkl› izolatlardan elde edilen ço¤altma ürünleri. Bu ürünlerin elektroforezi sonucu elde edilen bant paternleri. (Kolon1: Molekül a¤›rl›k standard› Kolon 2-7,10 ve 11: Ayn› bant paterni gösteren izolatlar; Kolon 8 ve 9: Farkl› bant paterni gösteren izolatlar). bu amaç için yetersiz olup inhibisyon zon çaplar›n›n de¤erlendirilmesi gerekir (14). Bu çal›flmada kullan›lan kantitatif antibiyogram tipleme inhibisyon zon çaplar›n› de¤erlendirerek yap›lmakta ve antibiyogram tiplemenin tüm avantajlar›n› içermektedir. MRSA kökenlerinin moleküler tiplemesi temel ve epidemiyolojik MRSA çal›flmalar›nda büyük ümitler vaad etmektedir. Halen alt›n standart olarak kabul edilen faj tipleme yerine PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis) tekni¤i önerilmektedir (26). Buna karfl›n zahmetli ve zaman al›c›, bu nedenle de rutin kullan›ma uygulanamayacak bu yöntemin yerine kromozomal DNA’daki de¤ifliklikleri saptamaya yarayan di¤er tipleme yöntemlerine e¤ilim çok daha güçlüdür. Bu yöntemlerden biri olan AP-PCR’›n en önemli avantajlar› çok yönlülü¤ü ve teknik aç›dan basitli¤idir. Deney koflullar› standardize edildikten sonra 48 saat gibi çok k›sa bir sürede bir çok köken birden çal›fl›labilerek bir bölgedeki veya hastanedeki epideminin kayna¤› saptanabilir (27). Epidemiyolojik verileri önemsemeden yaln›zca tipleme yöntemine güvenilmemelidir. Yöntemlerin karfl›laflt›rmal› çal›flmalar›nda “alt›n standart” toplanan epidemiyolojik veriler olmal›, laboratuvar verileri bu verilerle birlikte yoHastane ‹nfeksiyonlar› Dergisi 1997; 1: 2 Kantitatif antibiyogramda büyük gruba dahil edilen, ancak AP-PCR taraf›ndan farkl› bulunan izolat 14, acil servise baflvuran bir hastaya aittir ve hastane içi kökenlerle epidemiyolojik ba¤lant›s› oldu¤una dair bir bulgu saptanamam›flt›r. Bu durum kantitatif antibiyogram›n az da olsa rastlanan bir zay›fl›¤› olarak düflünülmüfltür. Koroner yo¤un bak›mdan izole edilen izolat 2 ve gö¤üs hastal›klar› servisinde saptanan izolat 15 kantitatif antibiyogramda büyük gruptan ayr› olacak flekilde bir gruba sokulmufl, ancak APPCR taraf›ndan büyük gruptan ay›rt edilememifltir. Bu iki izolat için de hastanedeki di¤er kökenlerle epidemiyolojik ba¤lant› kurulamam›fl ve sporadik olarak nitelendirilmifllerdir. Bu durumda AP-PCR yönteminin ay›rt edici gücü zay›f kalm›fl, kantitatif antibiyogram ise bu iki izolat› büyük gruptan ay›rd›¤› halde birbirinden ay›ramam›flt›r. ‹zolat 1 ve 4 de kantitatif antibiyogram ile ay›rt edilmifl, ancak AP-PCR ile büyük gruptan ayr›lamam›flt›r. ‹zolat 1 iç hastal›klar› servisinde saptanan en eski MRSA’d›r ve sonradan kronik böbrek yetmezli¤i nedeniyle diyalize al›nan iç hastal›klar› servisinin di¤er üç hastas›ndan izole edilen MRSA’larla zaman fark› oldukça fazlad›r. ‹zolat 4 ise beyin cerrahisi servisindeki en eski izolatt›r. Dolay›s›yla bu iki izolat bu servislerde daha sonra görülen bask›n klonla epidemiyolojik olarak ba¤lant›s›z görülmektedir. Olas›l›kla bu iki servis hastane içindeki bask›n kökeni daha sonradan ortopedi veya merkez yo¤un bak›m ünitesi (MYBÜ)’nden alm›fllard›r. O halde, APPCR bu bahsedilen izolatlar için zay›f ay›rt edici güçte kalm›fl olabilir. MRSA için kullan›lan tipleme yöntemlerinin uyuflmayan sonuçlar›n› yorumlamak için herhangi bir ilke saptanmam›flt›r. Bu durumda bir yöntemin fazla ay›rt edici oldu¤u ileri sürülebilir (28). Ancak çok say›daki MRSA klonu endemik bir MRSA zeminine toplumdan veya di¤er hastanelerden yeni kökenlerin araya giriflini de yans›tabilir. Bu durumda toplum ve 113 Metisiline Dirençli Staphylococcus aureus’un Kantitatif Antibiyogram ve “Arbitrarily Primed” PCR (AP-PCR) Yöntemleriyle Epidemiyolojik Sürveyans› Otkun M, Akata F, Kocagöz S, Tatman-Otkun M, Çetinkaya Y, Teker B, Dündar V, Ünal S. di¤er hastaneler farkl› MRSA kökenleri için sürekli bir kaynak oluflturmaktad›rlar (29). mecA geni bulunamayan, ancak oksasilin M‹K de¤eri 256 µg/mL’den yüksek bulunan izolat 16 her iki yöntemle de ay›rt edilebilmifltir. Bu çal›flmada hem kantitatif antibiyogram, hem de AP-PCR tipleme yöntemleri de¤iflik kökenlerin araya girmesine karfl›n bir özel kökenin zaman içinde TÜH’de endemik hale geldi¤ini göstermektedir. Bu kökenin ilk örne¤i izolat 3 olup Ekim 1994’te ortopedi klini¤inde saptanm›flt›r. Bu klonun TÜH’e girifli çal›flma dönemimiz öncesinde de olabilir. MYBÜ ise 1995 y›l› içinde aç›lm›flt›r ve bu birimde ilk izolasyon 11.8.1995’te trafik kazas› nedeniyle yat›r›lan bir hastaya aittir. Bu nedenle MYBÜ’de sonradan endemik hale geçen klonun ilk kayna¤›n›n ortopedi oldu¤u düflünülmüfltür. Yerleflmeyi kolaylaflt›racak di¤er faktörler ise olas›l›kla yüksek hasta say›s›, yetersiz personel, bu iki faktörün etkiledi¤i infeksiyon kontrol önlemlerinde, baflta el y›kama olmak üzere aksamalar ve son olarak MRSA yerleflimini kolaylaflt›racak afl›r› antibiyotik kullan›m›d›r. Üçüncü kuflak sefalosporinler, imipenem ve aminoglikozitlerin yo¤un kullan›m› MRSA kökenlerinde di¤er S. aureus kökenleri içinde seçici bask› sa¤layarak yay›lmay› kolaylaflt›rmaktad›r (30). Bu say›lan faktörler özellikle hastanemiz yo¤un bak›m biriminde belirgindir. Daha sonra MYBÜ tüm hastaneye klonun yay›lmas› için merkez görevini görmüfltür. Hastane içinde de¤iflik servislere yay›l›m›n yolu servisler aras› nakledilen hastalar yan› s›ra konsültan hekimler hatta t›p ö¤rencileri olabilir. Sonuç olarak S. aureus izolatlar› içinde 1995 y›l›nda %48’e ulaflan metisilin direnci nedeniyle TÜH flu anda MRSA’n›n endemik oldu¤u bir hastanedir. Direnç özellikle bir klonun yay›lmas›na ba¤l›d›r. Hastanemiz infeksiyon kontrol ekibi taraf›ndan mücadele sürdürülmekte ise de halen bu klonun eradike edilmesi güç görünmektedir. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. KAYNAKLAR 1. 2. 3. Barber M. Methicillin resistant stapylococci. J Clin Pathol 1961;14:385. Brumfitt W, Hamilton-Miller J. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus. N Eng J Med 1989; 320:1188-96. Ar›kan S, Taflova Y, Gür D, Özkuyumcu C, Ünal S, Akal›n HE. Klinik örneklerden izole edilen stafilokoklar›n antibiyotiklere duyarl›l›klar›n›n araflt›r›lmas›. 5. Ulusal ‹nfeksiyon Hastal›klar› Kongresi, 46 Eylül 1995, ‹stanbul, Kongre Kitab› 1995;42. 114 16. 17. Gürler N, Öngen B, Atilla A, Öksüz L, Töreci K. Gram pozitif koklarda seçimsiz duyarl›l›k deneylerinde saptanan direnç oranlar›. ANKEM Derg 1995;9:109. Öztürk R, Midilli K, Ergin S, Aygün G. Cerrahpafla T›p Fakültesi kliniklerinde yatan hastalar›n klinik materyallerinden izole edilen stafilokoklar›n antimikrobik maddelere duyarl›l›¤›. ANKEM Derg 1995;9:105. Çetinkaya Y, Ünal S: Metisilin Derinçli Staphylococcus aureus infeksiyonlar›: Epidemiyoloji ve kontrol. Flora 1996;1(3 ek):3-16. Akgül A, Dündar V, Metin T, Selçuk S: Haydarpafla Numune Hastanesi’nde burun tafl›y›c›lar›ndan izole edilen Staphylococcus aureus sufllar›nda oksasilin direnci. ANKEM Derg 1992;6:14-9. Fang FC, McClelland M, Guiney D, et al. Value of molecular analysis in a nozocomial methicillin-resistant Staphylococcus aureus outbreak. JAMA 1993;270:1323-8. Kreiswirth B, Kornblum J, Arbeit RD, et al. Evidence for a clonal origin of methicillin resistance in Staphylococcus aureus. Science 1993;259:227-30. Tenover FC, Arbeit R, Archer G, et al. Comparison and molecular methods of typing isolates of Staphylococcus aureus. J Clin Microbiol 1994;32:407-15. Mulligan ME. Epidemiologic and clinical utility of typing systems for differentiating among strains of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Infect Cont Hosp Epidemiol 1991;12:20-8. Blanc DS, Christiane P, Moreillon P, Wenger A, Bille J, Francioli P. Quantitative antibiogram as a typing method for the prospective epidemiological surveillance and control of MRSA: Comparison with molecular typing. Infect Cont Hosp Epidemiol 1996;17:654-9. Giacca M, Menzo S, Trojan S, Monti-Bragadin C. Cluster analysis of antibiotic susceptibility patterns of clinical isolates as a tool in nozocomial infection surveillance. Eur J Epidemiol 1987;3:155-63. Blanc DS, Lugeon C, Wenger A, Siegrist HH, Francioli P. Quantitative antibiogram typing using inhibition zone diameters compared with ribotyping for epidemiological typing of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. J Clin Microbiol 1994;32:2505-9. Otkun M, Akata F, Teker B ve arkadafllar› Nozocomial infections in a third level education hospital in Türkiye: Trakya University Hospital - 1995. First European Congress of Chemotherapy. 14-17 May 1996 Glaskow, Scotland. Abstract Book, Abstract No:185. Kloos WE, Lambe WD Jr. Staphylococcus. In: Balows A, Hausler WJ Jr, Herrman KL, Isenberg HD, Shadomy HJ (ed). Manual of Clinical Microbiology. Fifth edition. Washington DC. American Society for Microbiology 1991:222-7. National Committee for Clinical Laboratory Stardards. Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically, Third edition; Approved standard. NCCLS Document M7-A3, Villanova, PA: NCCLS, 1993. Hastane ‹nfeksiyonlar› Dergisi 1997; 1: 2 Metisiline Dirençli Staphylococcus aureus’un Kantitatif Antibiyogram ve “Arbitrarily Primed” PCR (AP-PCR) Yöntemleriyle Epidemiyolojik Sürveyans› 18. Richard P, Meyran M, Carpentier E, Thabaut A, Drugeon HB. Comparison of phenotypic methods and DNA hybridization for detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. J Clin Microbiol 1994;32:613-7. 19. Unal S, Hoskins J, Flokowitsch JE, Ernie Wu CY, Preston DA, Skatrud PL. Detection of methicillinresistant staphylococci by using the polymerase chain reaction. J Clin Microbiol 1992;30:1685-91. 20. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests, Fourth edition. Approved standard, NCCLS Document M2-A4, vol.10. Villanova, PA: NCCLS, 1990. 21. Bellum A, Kluytumans J, Leeuwen et al. Multicenter evaluation of Arbitrarily primed PCR for typing of Staphylococcus aureus strains. J. Clin Microbiol; 1995;33:1537-1547. 22. Liu PY, Shi Z, Lau Y et al. Use of restriction endonuclease analysis of plasmids and pulsed fiels gel electrophoresis to investigate outbreaks of methicillin-resistant Staphylococcus aureus infection. Clin Infect Dis 1996;22:86-90. 23. Mulligan ME, Arbeit RD: Epidemiologic and clinical utility of typing systems for differentiating among strains of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Infect Cont Hosp Epidemiol 1991;12:208. 24. Maslow JN, Mulligan ME, Arbeit RD: Molecular epidemiology: The application of contemporary techniques to typing bacteria. Clin Infect Dis 1993;17:153-62. 25. Archer GL, Mayhall CG. Comparison of epidemiological markers used in the investigation of an outbreak of methicillin-resistant Staphylococcus aureus infection. J Clin Microbiol 1983:18;395-9. Hastane ‹nfeksiyonlar› Dergisi 1997; 1: 2 Otkun M, Akata F, Kocagöz S, Tatman-Otkun M, Çetinkaya Y, Teker B, Dündar V, Ünal S. 26. Saulnier P, Bourneix C, Prévost G, Andremont A. Random amplified polymorphic DNA assay is less discriminant than pulsed-field gel electrophoresis for typing strains of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. J Clin Microbiol 1993;31:982-5. 27. Struelens MJ, Bax R, Deplano A, Quint WGV, Van Belkum A. Concordant clonal delineation of methicillin-resistant Staphylococcus aureus by macrorestriction analysis and polimerase chain reaction genome fingerprinting. J Clin Microbiol 1993;31:1964-70. 28. Jorgensen M, Givney R, Pegler M, Vickery A, Funnell G. Typing multidrug resistant Staphylococcus aureus: Conflicting epidemiological data produced by genotypic and phenotypic methods clarified by phylogenetic analysis. J Clin Microbiol 1996;34:398-403. 29. Couto I, Melo-Christino J, Fernandes ML, et al. Unusually large number of methicillin-resistant Staphylococcus aureus clones in a Portuguese hospital. J Clin Microbiol 1995;33:2032-5. 30. Jacob J, Meers PD. Partial characterization of an endemic strain of a methicillin- and aminoglycoside-resistant Staphylococcus aureus (MARSA) homogeneously resistant to beta-lactam antibiotics. J Hosp Infect 1992;21:121-9. YAZIfiMA ADRES‹: Prof. Dr. Serhat ÜNAL Hacettepe Üniversitesi T›p Fakültesi ‹ç Hastal›klar› Anabilim Dal› ‹nfeksiyon Hastal›klar› Ünitesi 06100 Hacettepe-ANKARA 115