oCheck® DNA Ekstraksiyon Kiti Kullanım Talimatları - Greiner Bio-One

Transkript

Kullanım Talimatları
Xn
R 36/37/38-42,
S 22-24-26-37/39
18°
25°
IVD
Almanya'da Üretilmiştir
oCheck® DNA Ekstraksiyon Kiti
Tek Kolon Preparasyonu (Kat. No. 515 040)
8 Kolon Preparasyonu (Kat. No. 515 050)
Yalnızca profesyonel laboratuvar personeli tarafından
in-vitro tanılarda kullanılması içindir
Revizyon 00 / Şubat 2011
Greiner Bio-One GmbH
Maybachstr. 2 • 72636 Frickenhausen • Almanya
Tel No: +49 (0) 7022 948-0 • Faks +49 (0) 7022 948-514
info@de.gbo.com • www.gbo.com/bioscience
SEMBOLLER SÖZLÜĞÜ
!
en
Do not
reuse
Use by
Consult
Instructions for
Use
Catalog
Number
Manufacturer
In Vitro
Diagnostic Medical
Device
Temperature
limitation
Contents
sufficient
for <n>
tests
Irritant
Batch
code
Important
Note
de
Nicht
wiederverwenden
Mindestens
haltbar bis
Vor
Gebrauch
Anweisung
lesen
Katalognummer
Hersteller
In-vitroDiagnostikum
Temperaturbegrenzung
Inhalt
ausreichend für
<n> Tests
Reizend
Chargenbezeichnung
Wichtiger
Hinweis
fr
Ne pas
réutiliser
Date
limite de
conservation
jusqu’au
Lire les instructions
avant
utilisation
Numéro
de référence
Fabricant
Produit
médical de
diagnostic
in-vitro
Limite de
température
Contenu
suffisant
pour <n>
tests
irritant
No de lot
Note importante
es
No utilizar
más
A utilizar
preferiblemente
antes de
Antes
de usar,
lea las
instrucciones
Número
de catálogo
Fabricante
Producto
medicinal
de
diagnóstica in vitro
Limitación
de
temperatura
Contenido
suficiente
para <n>
ensayos
irritante
Código de
lote
Nota importante
it
Non
riutilizzabile
Da
utilizzare
entro e
non oltre
Leggere
le istruzioni prima
dell’uso
Numero
catalogo
Produttore
Dispositivo
medicodiagnostico in-vitro
Limiti di
temperatura
Contenuto
sufficiente
per <n>
test
Irritante
Codice
del lotto
Nota importante
pt
Não utilzar mais
A utilizar
preferívelmente
antes de
Antes de
usar, leia
as instruções
Número
de catálogo
Fabricante
Producto
medicinal
de
diagnóstica in vitro
Limitação
de
temperatura
Conteúdo
suficiente
para <n>
ensaios
irritante
Código do
lote
Aviso importante
nl
Niet
opnieuw
gebruiken
Tenminste
houdbaar
tot
Gebruiksaanwijzing lezen
Catalogusnummer
Fabrikant
In vitro
diagnostisch
medisch
product
Temperatuurbeperking
Voldoende inhoud
voor <n>
tests
Irriterend
Lot
nummer
Belangrijke opmerking
da
Må ikke
genbruges
Anvendes
senest
Læs
brugsanvisningen
Katalognummer
Producent
In vitro
meskdicin
doagnoseapparat
Temperaturbegraensær
Indeholder nok til
<n> test
Lokalirriterende
Lotnummer
Vigtig
henvisning
sv
Får ej
återanvändas
Sista förbrukningsdag
Läs bruksanvisningen före
användning
Katalognummer
Tillverkare
In vitromedicinsk
doagnostisk
apparatur
Temperatur-begränsning
Innehållet
räcker till
<n> tester
irriterande
Lot
nummer
Viktigt
meddelande
pl
Nie
stosować
ponownie
Termin
zydatności
Przed
użyciem
przeczytać
instrukcję
Numer
katalogowy
Producent
Diagnostyka
in vitro
Produkt
yw
Ograniczenie
temperatury
Zawartość
wystarcza
na <n>
testów
drażniący
Kod partii
Ważne
no
Må ikke
brukes
flere
ganger
holdbar til
Les
bruksanvisning før
bruk
katalognummer
produsent
in vitro-diagnostisk
medisinsk
utstyr
temperaturbegrensning
Innhold
tilstrekkelig for <n>
tester
irriterende
batch nr.
Viktig
merknad
el
Προϊόν
μίας
χρήσης
Χρήση
έως
Συμβουλευτείτε
τις
Οδηγίες
χρήσης
Αριθμός
καταλόγου
Κατασκευαστής
In Vitro
διαγνωστική ιατρική
συσκευή
Περιορισμοί
θερμοκρασίας
περιέχει
επαρκές
υλικό για
< n > δοκιμασίες
Ερεθιστικό
Κωδικός
παρτίδας
Σημαντική
σημείωση
tr
Yeniden
ullanmayın
Son
kullanma
tarihi:
Kullanmadan önce
talimatı
okuyun
Katalog
numarası
Üretici
firma
In vitro
diagnostik
tıbbi tanı
ürünü
Sıcaklık
sınırlaması
İçeriği
<n> test
için yeterlidir
Tahriş
edici
Parti kodu
Önemli
Not
2
oCheck® DNA Ekstraksiyon Kiti - Kullanım Talimatları
İÇİNDEKİLER
1.
2.
KİTİN İÇERİĞİ.............................................................................................................. 5
GEREKEN SARF MALZEMELERİ VE EKİPMANLAR................................................ 6
2.1 Tek Kolon Preparasyonu (Kat. No. 515 040)................................................................................. 6
2.2 8 Kolon Preparasyonu (Kat. No. 515 050)..................................................................................... 7
3.
4.
5.
6.
NAKLİYE VE SAKLAMA.............................................................................................. 8
GÜVENLİK TALİMATLARI........................................................................................... 8
ATIKLARIN YOK EDİLMESİ........................................................................................ 9
GİRİŞ.......................................................................................................................... 10
6.1 Kullanım amacı.............................................................................................................................. 10
6.2 Yanlış kullanım.............................................................................................................................. 10
6.3 Numune materyali......................................................................................................................... 11
6.4 DNA saflaştırma işleminin temel prensibi................................................................................... 11
7.
oCheck® İŞ AKIŞI TALİMATLARI.............................................................................. 12
7.1 Genel talimatlar ............................................................................................................................ 12
7.2 Oda ayrımı...................................................................................................................................... 12
7.3 Uyarılar ve önlemler...................................................................................................................... 13
7.3.1 Kontaminasyonun önlenmesi...............................................................................................13
7.3.2 Genel önlemler.....................................................................................................................13
7.3.3 Güvenli çalışma...................................................................................................................14
8.
TEK KOLON PREPARASYONU (Kat. No. 515 040)................................................. 15
8.1 Çalışma solüsyonlarının preparasyonu ve saklama koşulları.................................................. 15
8.2 Numune preparasyonu................................................................................................................. 16
8.2.1 PapilloCheck® ve PapilloCheck® high-risk için numune preparasyonu..............................16
8.2.2 PelvoCheck® CT/NG için numune preparasyonu................................................................16
8.3 Standart protokol.......................................................................................................................... 17
8.3.1 Preparasyon.........................................................................................................................17
8.3.2 Ön Lizis................................................................................................................................17
8.3.3 Lizis......................................................................................................................................17
8.3.4 DNA bağlama şartlarını ayarlama........................................................................................18
8.3.5 DNA Bağlama......................................................................................................................18
8.3.6 Spin Kolonları Yıkama.........................................................................................................18
8.3.7 Spin Kolonları Kurutma........................................................................................................19
8.3.8 DNA elüsyonu......................................................................................................................19
3
9.
KURULUM VE ÇALIŞTIRMA KILAVUZU
oCheck® VAC SET VE oCheck® VAC PUMP............................................................. 20
9.1 Ürün İçeriği.................................................................................................................................... 20
9.1.1 oCheck® VacSet...................................................................................................................20
9.1.2 oCheck® VacPump...............................................................................................................21
9.2 oCheck® VacSet'in Montajı........................................................................................................... 22
9.2.1 DNA bağlama ve yıkama için kurulum.................................................................................22
9.2.2 DNA elüsyonu için kurulum..................................................................................................23
9.3 oCheck® VacPump'ın Montajı....................................................................................................... 24
9.4 Vakumu kurma............................................................................................................................... 24
9.5 Vakum uygulama........................................................................................................................... 24
9.6 Manifoldu havalandırma............................................................................................................... 25
10. 8 KOLON PREPARASYONU (Kat. No. 515 050)...................................................... 25
10.1 Çalışma solüsyonlarının preparasyonu ve saklama koşulları................................................. 25
10.2 Numune preparasyonu................................................................................................................ 26
10.2.1 PapilloCheck® ve PapilloCheck® high-risk için numune preparasyonu............................26
10.3 Standart protokol......................................................................................................................... 27
10.3.1Preparasyon.........................................................................................................................27
10.3.2Ön Lizis................................................................................................................................27
10.3.3Lizis......................................................................................................................................27
10.3.4DNA bağlama şartlarını ayarlama........................................................................................28
10.3.5DNA Bağlama......................................................................................................................28
10.3.6Bağlama Şeritlerini Yıkama..................................................................................................30
10.3.7Bağlama Şeritlerini Kurutma................................................................................................31
10.3.8DNA Elüsyonu......................................................................................................................31
11.
12.
13.
14.
SORUN GİDERME..................................................................................................... 33
TEKNİK YARDIM........................................................................................................ 35
PERFORMANS ÖZELLİKLERİ.................................................................................. 35
KISA PROTOKOLLER............................................................................................... 35
14.1 Tek Kolon Preparasyonu (Kat. No. 515 040) için kısa protokol................................................ 35
14.2 8 Kolon Preparasyonu (Kat. No. 515 050) için kısa protokol................................................... 37
4
1. KİTİN İÇERİĞİ
oCheck®
DNA Ekstraksiyon Kiti
Adı
Tek Kolon
Preparasyonu
(Kat. No. 515 040)
8 Kolon
Preparasyonu
(Kat. No. 515 050)
BUF
L1
Tampon L1
20 ml
20 ml
BUF
L2
Tampon L2
12 ml
24 ml
REAG
L3
Reaktif L3
3 ml
6 ml
BUF
W1
Tampon W1
30 ml
75 ml
BUF
W2
Tampon W2 (konsantre)
14 ml
50 ml
BUF
E
Tampon E
15 ml
50 ml
Proteinaz K (liyofilize)
30 mg
75 mg
Proteinaz Tampon PKB
1,8 ml
3,6 ml
Taşıyıcı RNA (liyofilize)
0,3 mg
0,3 mg
Spin Columns
Spin Kolonlar
50
-
Collection Tubes
Toplama Tüpleri
250
-
Binding Strips
Bağlama Şeritleri
-
12
Paper Sheet
Kağıt Yaprağı
-
10
Tampon L4 için Etiket
1
1
Kılavuz Talimatlarını Yükleme
1
1
Proteinase
Proteinase
Carrier
BUF
K
BUF PKB
RNA
L4
5
2. GEREKEN SARF MALZEMELERİ VE EKİPMANLAR
2.1
Tek Kolon Preparasyonu (Kat. No. 515 040)
Sarf Malzemeleri
oCheck® DNA Ekstraksiyon Kiti –
Tek Kolon Preparasyonu
Greiner Bio-One Kat. No.
Miktar (parça)
515 040
50 preparasyon
765 288
774 288
772 288
739 288
750 288
96
96
96
96
60
Steril, DNase içermeyen mikropipet filtre ucu
0,5-10 µl filtre uçları
10-100 µl filtre uçları
Gereken ek sarf malzemeleri
•Lizis adımları için emniyet kapaklı veya vidalı kapaklı 1,5 veya 2,0 ml'lik reaksiyon tüpü
•Etanol p.a. ≥ %99,8
•Tek kullanımlık eldivenler
Gereken ek ekipmanlar
•1,5 veya 2,0 ml'lik reaksiyon tüpleri ve 11.000 g için uygun mikrosantrifüj
•Vorteks mikser
•70 °C ve 56 °C inkübasyonda kullanılacak 1,5 veya 2,0 ml'lik reaksiyon tüpleri için uygun termoblok, su banyosu veya
termomikser
•1-1000 μl arasında değişen mikropipetler
•Atık kabı
•Süreölçer
6
2.2
8 Kolon Preparasyonu (Kat. No. 515 050)
Sarf Malzemeleri
Greiner Bio-One Kat. No.
Miktar (parça)
515 050
12 x 8 preparasyon
765 288
774 288
772 288
739 288
750 288
96
96
96
96
60
PCR tüpü 8'li strip
8'li tüp strip için başlık stripi
Tekli PCR tüpleri
673 210
373 270
671 201
125
125
500
Greiner Bio-One Cat. No.
Miktar (parça)
oCheck® VacSet
863 080
1
oCheck® VacPump
863 070
1
oCheck® DNA Ekstraksiyon Kiti –
8 Kolon Preparasyonu
Steril, DNase içermeyen mikropipet filtre ucu
Ekipman
Gereken ek sarf malzemeleri
•Lizis adımları için emniyet kapaklı veya vidalı kapaklı 1,5 veya 2,0 ml'lik reaksiyon tüpü
•Çok kanallı pipet rezervuarı (tek kullanımlık reaktif rezervuarları), hacimler: 25 ve 100 ml
•8 kanallı pipet için pipet uçları (1200 μl hacim için yeterli)
•Etanol p.a. ≥ %99,8
•Tek kullanımlık eldivenler
Gereken ek ekipmanlar
•1,5 veya 2,0 ml'lik reaksiyon tüpleri ve 11.000 g için uygun mikrosantrifüj
•Vorteks mikser
•70 °C ve 56 °C inkübasyonda kullanılacak 1,5 veya 2,0 ml'lik reaksiyon tüpleri için uygun termoblok, su banyosu veya
termomikser
•1-1000 μl arasında değişen mikropipetler
•Büyük hacimler için (50 ila 1200 μl) 8 kanallı multipipet
•Atık kabı
•Süreölçer
•PCR rafı
7
3. NAKLİYE VE SAKLAMA
oCheck® DNA Ekstraksiyon Kiti, oda sıcaklığında saklanır ve nakledilir. Hazırlanan çalışma
solüsyonlarının saklama koşulları için bkz. bölüm 8.1 ve 10.1.
4. GÜVENLİK TALİMATLARI
oCheck® DNA Ekstraksiyon Kitinin aşağıdaki bileşenleri tehlikeli maddeler içerir.
Eldiven ve koruyucu gözlük takın ve bu bölümde yer alan talimatlara uyun.
Bileşen
Tehlikeli
Maddeler
Tampon L2
Guanidin
hidroklorür
Tampon W1
Guanidin
hidroklorür +
izopropanol < %25
Proteinaz K
Tehlike
Sembolü
Proteinaz K,
liyofilize
*
*
*
Risk
İfadeleri
Risk
İfadeleri
Güvenlik
İfadeleri
Yutulması zararlıdır,
Gözleri ve cildi tahriş
eder
R 22-36/38
Yanıcıdır,
Yutulması zararlıdır,
Gözleri ve cildi tahriş
eder
R 10-22-36/38
S7-16-25
Gözleri,
solunum sistemini
ve cildi tahriş eder,
Solunduğunda
hassaslaşmaya
neden olabilir
R 36/37/38-42
S 22-24-26-36/37
* Her bir şişe miktarının 125 g veya ml'nin altında olduğu durumlarda tehlike etiketine gerek yoktur (67/548//EEC Md. 25,
1999/45/EC Md. 12 ve German GefStoffV § 20 (3) ve TRGS 200 7.1 uyarınca). Daha fazla bilgi için bkz. Güvenlik Veri Formu.
Risk İfadeleri
R10 R22 R 36/37/38 R 36/38 R 42 Yanıcıdır
Yutulması zararlıdır
Gözleri, solunum sistemini ve cildi tahriş eder
Gözleri ve cildi tahriş eder
Solunduğunda hassaslaşmaya neden olabilir
Güvenlik İfadeleri
S7 Kabı sıkıca kapalı tutun
S16 Tutuşma kaynaklarından uzak tutun - Sigara içilmez
S 22 Tozu solumayın
S 24 Cilde temasından kaçının
S 25 Gözlere temasından kaçının
S 26 Gözlerle temas etmesi durumunda gözleri derhal bol suyla yıkayın ve tıbbi yardım alın
S 36/37 Uygun koruyucu giysi ve eldiven kullanın
Bu ürüne ait güncel Güvenlik Veri Formu, Greiner Bio-One internet sitesinden indirilebilir:
www.gbo.com/bioscience/biochips_download
8
5. ATIKLARIN YOK EDİLMESİ
Tampon L2 ve W1 içindeki guanidin hidroklorür, ağartma maddesiyle birleştiğinde son derece reaktif
bileşenler oluşturabilir. Numune preparasyon atığına ağartma maddesi veya asidik solüsyonlar
doğrudan eklenmemelidir.
Sıvı atıkların bulaşıcı kalıntı maddelerle kirlenmesi çok düşük bir ihtimal olmakla birlikte tamamen
imkansız değildir. Bu nedenle sıvı atık bulaşıcı olarak kabul edilmeli ve yerel güvenlik düzenlemelerine
uygun şekilde alınıp imha edilmelidir. Lütfen federal ve yerel yönetimlerin yanı sıra eyaletlerin atık
bertarafıyla ilgili kılavuz ilkelerine dikkatle uyun.
9
6. GİRİŞ
6.1
Kullanım amacı
oCheck® DNA Ekstraksiyon Kiti (Greiner Bio-One; Kat. No. 515 040 veya Kat. No. 515 050) bir in
vitro tıbbi tanı kitidir ve oCheck® ürün serisi ile yapılacak denemelerle analiz edilmek üzere insan
kaynaklı numuneler ile yapılacak DNA preparasyonunda kullanım içindir.
oCheck® DNA Ekstraksiyon Kiti değişkenleri tarafından kullanılan nükleik asit izolasyon metodolojisi,
aşağıda yer alan kitlerle yapılacak doğrudan işlem sonrası analiz için uygun DNA üretir:
oCheck® DNA Ekstraksiyon Kiti - Tek Kolon Preparasyonu (Kat. No. 515 040)
• PapilloCheck® (Greiner Bio-One; Kat. No. 465 060)
• PapilloCheck® high-risk (Greiner Bio-One; Kat. No. 505 060)
• PelvoCheck® CT/NG (Greiner Bio-One; Kat. No. 504 002)
oCheck® DNA Ekstraksiyon Kiti - 8 Kolon Preparasyonu (Kat. No. 515 050)
• PapilloCheck® (Greiner Bio-One; Kat. No. 465 060)
• PapilloCheck® high-risk (Greiner Bio-One; Kat. No. 505 060)
Validasyon tamamlanana kadar PelvoCheck® CT/NG (Greiner Bio-One; Kat. No. 504 002) deneyi
ile yapılacak işlem sonrası analiz için DNA izole etmek amacıyla oCheck® DNA Ekstraksiyon Kiti - 8
Kolon Preparasyonunun kullanılması tavsiye edilmez.
oCheck® DNA Ekstraksiyon Kiti, yalnızca oCheck® ürün serisi (Greiner Bio-One, Frickenhausen,
Almanya) ile yapılacak deneylerle birlikte kullanıma yöneliktir. Bu ürün serilerindeki kullanım
talimatlarında oCheck® DNA Ekstraksiyon Kitini kullanma yöntemleri belirtilmektedir.
oCheck® DNA Ekstraksiyon Kiti, İn Vitro Tıbbi Tanı Cihazı Direktifinin (98/79/EC) koşullarına
uyduğundan dolayı CE uyum işareti taşımaktadır.
Ürün, YALNIZCA moleküler biyolojik teknikler konusunda uzmanlaşmış teknisyenler ve doktorlar gibi
profesyonel kullanıcılar tarafından kullanma amaçlıdır.
6.2
Yanlış kullanım
oCheck® DNA Ekstraksiyon Kiti, KESİNLİKLE CarnoCheck® (Greiner Bio-One), ParoCheck® (GreinerBio-One) veya oCheck® ürün serisinden olmayan herhangi bir ürünle birlikte kullanılmamalıdır.
10
6.3
Numune materyali
PapilloCheck® (Greiner Bio-One; Kat. No. 465 060) ve PapilloCheck® high-risk (Greiner Bio-One;
Kat. No. 505 060) işlem sonrası uygulama için oCheck® DNA Ekstraksiyon Kiti, aşağıdaki numune
toplama sistemlerinden biriyle toplanmış insan servikal smear'lerinden viral ve insan genomik
DNA'sı ekstrakte etmek için tasarlanmış ve test edilmiştir:
•
•
•
•
PapilloCheck® Toplama Kiti (Greiner Bio-One; Kat. No. 465 070)
PreservCyt® (Hologic, Bedford, MA, ABD)
SurepathTM (BD, Franklin Lakes, NJ, ABD)
STMTM (Qiagen, Hilden, Almanya)
PelvoCheck® CT/NG (Greiner Bio-One; Kat. No. 504 002) deneyi işlem sonrası uygulama için oCheck®
DNA Ekstraksiyon Kiti, aşağıdaki toplama sistemlerinden biri kullanılarak insan idrar örneklerinden
elde edilen bakteriyel ve insan genomik DNA'sını ekstrakte etmek için valide edilmiştir:
•
•
PelvoCheck® Toplama Kiti SAFE (Greiner Bio-One; Kat. No. 453 100)
PelvoCheck® Toplama Kiti STRAW (Greiner Bio-One; Kat. No. 453 101)
Diğer numune toplama sistemleri valide edilmemiştir ve oCheck® DNA Ekstraksiyon Kiti ile
kullanılmamalıdır.
6.4
DNA saflaştırma işleminin temel prensibi
oCheck® DNA Ekstraksiyon Kiti, insan kaynaklı numunelerden elde edilen viral, bakteriyel ve insan
genomik DNA'sının saflaştırması için tasarlanmıştır. Numune materyali, Proteinaz K ve Tampon L1
eklenerek hızlı ve etkili bir şekilde lize edilir. Lizis tamponu ve etanol, nükleik asitlerin Bağlanma
Kolonunun silika membranına bağlanması için uygun koşulları oluşturur. Taşıyıcı RNA, düşük
konsantrasyonlu viral, bakteriyel ve genomik DNA'nın bağlanması ve geri kazanımını güçlendirir.
Tuzlar, metabolitler ve çözünebilir makromoleküler hücresel komponentler gibi kontaminant unsurlar
(potansiyel PCR inhibitörleri), etanolik yıkama tamponlarıyla yıkama adımları sırasında ortadan
kaldırılır. Saf bakteriyel, viral ve insan genomik DNA'sı son olarak, düşük iyonik güçteki koşullarda,
hafif alkalin elüsyon tamponuna elüe edilir. Saflaştırma işlemi sonrasında DNA, oCheck® ürün serisi
ile elde edilen deneylerle yapılacak doğrudan analiz için uygun bir solüsyon haline gelir.
11
7. oCheck ® İŞ AKIŞI TALİMATLARI
7.1
Genel talimatlar
Aşağıdaki talimatlar, moleküler biyolojide şu an kullanılmakta olan en son tekniklerin uygulanmasıyla
yapılan laboratuvar deneyimlerine dayanmaktadır ve PCR tabanlı yöntemler açısından maksimum
güvenliği sağlamayı hedeflemektedir. oCheck® DNA Ekstraksiyon Kitini, oCheck® ürün serisi ile
elde edilen deneylerle saflaştırılmış DNA'nın ileri işlem sonrası analiziyle birlikte kullanırken uygun
önlemler alınmalıdır.
DNA esktraksiyonu, amplifikasyonu ve tespiti gibi moleküler biyoloji proseslerinde genel olarak uygun
niteliklere sahip personel görev almalıdır. Ayrıca, numunelerdeki nükleik aside ait amplifikasyon
ürünleri tarafından kontaminasyon veya degradasyon oluşumu nedeniyle elde edilebilecek hatalı
sonuçlardan kaçınmak için, net ve iyi yapılandırılmış bir iş akışı gereklidir. Bunu sağlamak için,
ekstraksiyon ve amplifikasyon alanları ayrı olmalıdır.
Bir amplifikasyon ürünü, yalnızca ekstraksiyon için ayrılmış olan alana kesinlikle sokulmamalıdır.
Her iki alanda da ayrı ekipman, sarf malzemeleri, laboratuvar önlükleri ve eldivenler bulunmalıdır.
Ekstraksiyon için ayrılmış olan alana ait laboratuvar önlükleri, eldivenler veya ekipmanlar, kesinlikle
amplifikasyon için ayrılmış olan alana aktarılmamalıdır.
7.2
Oda ayrımı
Şekil 1 bir laboratuvarın nasıl 3 farklı bölüme ayrılabileceğine yönelik bir örnek göstermektedir.
Bu odalardan biri yalnızca DNA ekstraksiyonu için, diğeri PCR reaksiyonlarının kurulması ve
çalıştırılması için, sonuncusu ise hibridizasyon ve analiz için kullanılır. Her bir oda, numunelerin
kontaminasyonunu önlemek amacıyla, yalnızca belirtilen uygulama veya teknik için kullanılmalıdır.
Ekipmanların ve sarf malzemelerinin alanlar arasında yanlışlıkla yer değiştirmesini önlemek için renk
kullanılması yararlı olabilir.
!
Ekipmanlar ve sarf malzemeleri, farklı laboratuvar odaları ve alanları arasında yer değiştirmemelidir.
Bu nedenle, ekipmanların ve sarf malzemelerinin çift olarak temin edilmesine dikkat edilmelidir.
Oda 1
Oda 2
Oda 3
Şekil 1: oCheck® iş akışında oda ayrımı
Oda 1: DNA ekstraksiyonu, Oda 2: PCR reaksiyonunun kurulması ve reaksiyon karışımının temiz bir tezgahta ayrılması;
DNA şablonunun eklenmesi için ayrı bir alan; Oda 3: Hibridizasyon ve analiz
12
oCheck® DNA Ekstraksiyon Kiti ile yapılacak olan tüm DNA ekstraksiyon prosedürü, DNA ekstraksiyon
odası olan oda 1'de uygulanmalıdır. Bu odadan çıktıktan sonra, laboratuvar önlükleri değiştirilmelidir.
oCheck® iş akışında, DNA ekstraksiyonu, kontaminasyona en duyarlı olan prosestir, bu nedenle
bu belgede yer alan talimatlara kesinlikle uyulması son derece önemlidir. Buna ek olarak, 7.3.1
bölümünde yer alan kontaminasyonu önleme kılavuzlarına da uyulmalıdır.
Oda 2'de PCR reaksiyon karışımı kurulur ve temiz bir tezgah üzerinde ayrılır. Oda 1'de ekstrakte
edilen DNA, oda 2'de tahsis edilecek ayrı bir alanda eklenmelidir. Bu odadan çıktıktan sonra
laboratuvar önlükleri değiştirilmelidir.
Hibridizasyon reaksiyonu ve yıkama adımları, üçüncü laboratuvar odasında yapılır. Ayrıca,
CheckScannerTM ile CheckReportTMYazılımı da, oCheck® ürün serisi ile yapılacak deneylerin nihai
analizi için oda 3'te kurulur.
7.3
Uyarılar ve önlemler
7.3.1
Kontaminasyonun önlenmesi
•
Laboratuvar önlükleri: Prosedürlerin uygulanması sırasında laboratuvar önlükleri giyilmelidir
ve her bir laboratuvar odası için farklı laboratuvar önlük setleri bulunmalıdır.
•
Eldivenler: her bir analiz adımı sırasında eldiven takılmalı ve her farklı adımda eldivenler
değiştirilmelidir.
•
Laboratuvar temizliği: Çalışma yeri, çalışmadan önce ve sonra, uygun temizlik solüsyonlarıyla
dekontamine edilmelidir.
•
Reaksiyon tüpleri: Reaksiyon tüpü kapağının içine kesinlikle dokunulmamalıdır. Çapraz
kontaminasyondan kaçınmak için, her seferde yalnızca bir tüp açılmalıdır. Kontaminasyonu
önlemek için, lizis adımlarında emniyet kapaklı veya vidalı kapaklı reaksiyon tüpleri kullanılmalıdır.
•
Uygun mikropipet filtre uçları kullanılmalıdır (steril, DNase, RNase ve insan DNA'sı içermeyen).
Sıvı transferleri arasında pipet uçları daima değiştirilmelidir.
7.3.2
Genel önlemler
•
Teslim alındığında oCheck® DNA Ekstraksiyon Kiti bileşenlerini hasar bakımından kontrol edin.
Bileşenlerden biri hasar görmüşse (örn. tampon şişeleri), yerel Greiner Bio-One distribütörünüze
başvurun. Hasar görmüş kit bileşenlerini kullanmayın. Bu bileşenlerini kullanılması, kit
performansını zayıflatabilir.
•
Son kullanma tarihi geçmiş reaktifleri kullanmayın.
•
oCheck® DNA Ekstraksiyon Kitini, son kullanma tarihinden sonra kullanmayın.
•
Farklı serilere ait reaktifleri karıştırmayın.
•
Yalnızca kitle birlikte sağlanan ve üretici tarafından tavsiye edilen reaktifleri/ekipmanları kullanın.
•
Pipetler, su banyosu ve termoblok için düzenli olarak kalibrasyon ve kontrol yapılmalıdır.
•
Mikrolitre aralığına küçük miktarlarda sıvı pipetlemek zordur. Bu nedenle, mikropipetlerle
olabildiğince doğru bir şekilde pipetlemeye dikkat edin.
•
Tüm santrifüj adımları, oda sıcaklığında (18-25 °C) gerçekleştirilmelidir.
•
Kullanılmayan reaktifler ve atık materyal, federal yönetim ve eyalet düzeyindeki kılavuz ilkelere
uygun olarak bertaraf edilmelidir.
13
7.3.3
Güvenli çalışma
•
Bu kit yalnızca in vitro tanılarda kullanıma yöneliktir ve yalnızca in vitro tanılarda laboratuvar
uygulama deneyimine sahip eğitimli personel tarafından kullanılmalıdır.
•
Solüsyonları kesinlikle ağzınızla pipetlemeyin.
•
Çalışma alanlarında yiyecek ve içecek bulundurmayın, sigara içmeyin veya kozmetik ürünler
kullanmayın.
•
İnsanlara bulaşma potansiyeli taşıyan maddeler içeren biyolojik numunelerle işlem yaparken
dikkatli olun. Bulaşma potansiyeline sahip maddelerden enfeksiyon alma riskini azaltmak için,
numuneler lize edilene kadar, laminar hava akımı şartları altında çalışmanız tavsiye edilir. Tüm
biyolojik numuneleri, enfekte edici ajanlar taşıma kapasiteleri bulunuyormuş gibi kabul ederek
kullanın ve bertaraf edin. Biyolojik numunelere doğrudan temas etmekten kaçının, bu numuneleri
sıçratmayın ve püskürtmeyin.
•
Numuneleri ve reaktifleri kullandıktan sonra ellerinizi iyice yıkayın.
•
İnsan numuneleriyle çalışırken daima laboratuvar önlüğü giyin, eldiven takın ve koruyucu gözlük
kullanın. Bu ürüne ait Güvenlik Veri Formunun güncel sürümü Greiner Bio-One internet sitesinden
indirilebilir: www.gbo.com/bioscience/biochips_download
14
8. TEK KOLON PREPARASYONU (Kat. No. 515 040)
8.1
Çalışma solüsyonlarının preparasyonu ve saklama koşulları
Tüm kit komponentleri, oda sıcaklığında (18-25 °C) saklanmalıdır. Komponentler, üretildikten
sonra iki yıl süreyle stabildir.
oCheck® DNA Ekstraksiyon Kiti protokolüne başlamadan önce, aşağıdaki solüsyonları hazırlayın:
1. Proteinaz K solüsyonu: Kitin ilk kullanımından önce, liyofilize edilmiş Proteinaz K'nın çözünmesi
için 1,35 ml Proteinaz Tamponu (PKB) ekleyin. Solüsyonu alikuotlara bölün ve 6 aya kadar
-20°C'de saklayın. Tekrar dondurmayın.
2. Tampon W2: Tampon W2 konsantratına 56 ml etanol (p.a. ≥ %99,8) ekleyin. Şişenin etiketine
güncel tarihi not edin. Tampon W2, oda sıcaklığında (18-25 °C) bir yıla kadar stabildir.
3. Tampon L4: Tampon L2'yi Reaktif L3'e tamamen aktarın ve iyice karıştırın. Şişeye kitle birlikte
verilen L4 etiketini uygulayın. Şişenin etiketine güncel tarihi not edin. Elde edilen Tampon L4,
oda sıcaklığında (18-25 °C), bir yıla kadar stabildir..
4. Taşıyıcı RNA solüsyonu: Liyofilize edilen Taşıyıcı RNA'nın çözünmesi için 900 μl Tampon L1
ekleyin. Çözünen Taşıyıcı RNA’yı alikuotlara ayırın (örn. 12 ekstraksiyon için 35 ml’lik alikuotlar).
Çözünen Taşıyıcı RNA solüsyonunu, -20 °C'de saklayın. Tekrar dondurmayın! Kullanılmış
flakonlar çözündüklerinde imha edilmelidir.
Özellikle düşük sıcaklıklarda saklama sırasında, Tampon L1, L2 veya L4'te beyaz bir çökelti
oluşabilir. Bu çökeltiler, kullanımdan önce şişenin 50-70 °C'de inkübe edilmesiyle kolaylıkla
çözünebilir.
15
8.2
Numune preparasyonu
8.2.1
PapilloCheck® ve PapilloCheck® high-risk için numune preparasyonu
• PapilloCheck® Toplama Kiti (Greiner Bio-One; Kat. No. 465 070)
• PreservCyt® toplama ortamı (Hologic, Bedford, MA, ABD)
içinde toplanan insan servikal smear numuneleri, doğrudan işlenebilir.
•
SurepathTM toplama ortamı (BD, Franklin Lakes, NJ ABD) içinde toplanan servikal smear
numuneleri kullanılmadan önce yıkanmalıdır: 250 μl numuneyi, 5 dakika süreyle, 11.000 g
değerinde santrifüje tabi tutun ve pelleti 250 μl seyreltilmiş suda yeniden süspansiyon haline
getirin.
•
STMTM toplama ortamı (Qiagen, Hilden, Almanya) içinde toplanan servikal smear numuneleri,
seyreltilmiş suyla seyreltilmelidir: 100 μl numune + 150 μl seyreltilmiş su.
!
Genel olarak servikal smear numunesi çok konsantre ise ve zaten agrege olmuşsa, ekstraksiyona
başlamadan önce numunenin seyreltilmesi ve homojenize edilmesi gerekir!
Çok seyreltilmiş ve gözle görünür hücreleri göstermeyen servikal smear numuneleri, ekstraksiyon için daha
fazla hücre verimi elde etmek amacıyla konsantre edilmelidir. En fazla 1000 μl numuneyi, 5 dakika süreyle,
11.000 g değerinde santrifüje tabi tutun ve pelleti 250 μl seyreltilmiş suda yeniden süspansiyon haline
getirin.
Bu konsantrasyon adımı, yalnızca PapilloCheck® Toplama Kiti, PreservCyt® toplama ortamı veya
SurepathTM toplama ortamı ile toplanan servikal smear numuneleri için uygulanır. Eğer STMTM toplama
ortamı kullanılmışsa, santrifüj yoluyla konsantrasyon elde edilmesi mümkün değildir.
➠➠ 250 μl numune solüsyonunu, 1,5 ml veya 2 ml'lik reaksiyon tüpüne pipetleyin. Kontaminasyonu
önlemek için, lizis adımlarında kullanılan emniyet kapaklı veya vidalı kapaklı reaksiyon tüplerini
kullanın. Her bir DNA ekstraksiyon döngüsündeki tüm DNA izolasyon prosedürünün, bir negatif
numune kontrolü kullanılarak valide edilmesi tavsiye edilir.
8.2.2
PelvoCheck® CT/NG için numune preparasyonu
• PelvoCheck® Toplama Kiti SAFE (Greiner Bio-One; Kat. No. 453 100)
• PelvoCheck® Toplama Kiti STRAW (Greiner Bio-One; Kat. No. 453 101)
içinde toplanan insan idrar numuneleri, doğrudan işlenebilir.
➠➠ 250 μl idrar numunesini, 1,5 ml veya 2 ml'lik reaksiyon tüpüne pipetleyin. Kontaminasyonu
önlemek için, lizis adımlarında kullanılan emniyet kapaklı veya vidalı kapaklı reaksiyon tüplerinin
kullanılması tavsiye edilir. DNA ekstraksiyonunu valide etmek için, her bir ekstraksiyon
döngüsünde bir negatif numune kontrolü kullanılmalıdır.
16
8.3
Standart protokol
8.3.1
Preparasyon
➠➠ Santrifüjü oda sıcaklığına (18-25 °C) ayarlayın.
➠➠ Numuneleri bölüm 8.2'ye göre hazırlayın.
➠➠ Termoblokları veya su banyolarını, sırasıyla 56 °C ve 70 °C'ye ayarlayın.
➠➠ Elüsyondan önce, elüsyon Tampon E'yi, 70 °C'de inkübe edin.
➠➠ Çalışma solüsyonlarının bölüm 8.1'e göre hazırlanmasına dikkat edin.
8.3.2
Ön Lizis
➠➠ 80 μl Tampon L1 ekleyin.
➠➠ Hazırlanan Taşıyıcı RNA solüsyonundan 2,4 μl ekleyin.
➠➠ 20 μl Proteinaz K solüsyonu ekleyin.
➠➠ Kapağı kapatın ve puls vorteks uygulayarak kısa bir süre karıştırın.
➠➠ En az 30 dakika 56 ºC'de inkübe edin. Numuneleri, bir termo mikser yardımıyla 650 rpm'de
sallayın. Bir termoblok veya su banyosu kullanılıyorsa, numuneleri inkübasyon periyodu
süresince arada bir vorteksleyin.
!
8.3.3
Birçok numune işleniyorsa, Proteinaz K, Tampon L1 ve Taşıyıcı RNA kullanılmadan önce karıştırılmalıdır.
Tampon L1 ve Proteinaz K'yı, numunenin eklenmesinden önce 10–15 dakikadan daha fazla kesinlikle
karıştırmayın. Proteinaz K, substrat olmadan Tampon L1 içinde kendi kendine parçalanabilir.
Lizis
➠➠ Kapağın içindeki damlacıkları yok etmek için, reaksiyon tüpünü kısa bir süre santrifüje tabi tutun.
➠➠ Kapağı kapatın ve puls vorteks uygulayarak 10 saniye karıştırın.
➠➠ 15 dakika süreyle 70 ºC'de inkübe edin.
!
8.3.4
Kapakların kazara açılmasını önlemek için, reaksiyon tüplerinin ağızlarını sıkıca kapatın.
DNA bağlama şartlarını ayarlama
➠➠ Numuneye 300 μl etanol (p.a. ≥ %99,8) ekleyin.
➠➠ Kapağı derhal kapatın ve puls vorteks uygulayarak 15 saniye karıştırın.
17
8.3.5
DNA Bağlama
Kontaminasyonu önlemek için bu adımdan önce yeni eldivenler takın!
➠➠ Her bir numune için, bir Toplama Tüpü içine bir Spin Kolon yerleştirin.
➠➠ 450 μl lizatı, Spin Kolon'un içine dikkatlice yerleştirerek 1 dakika süreyle oda sıcaklığında
11.000 g değerinde santrifüje tabi tutun. Kalan lizatı atmayın!
➠➠ Tek kullanımlık Toplama Tüpünü atın.
➠➠ Yeni Toplama Tüpleri hazırlayın ve Spin Kolonları bu tüplere yerleştirin.
➠➠ Kalan 450 μl lizatı Spin Kolona pipetleyin.
➠➠ Oda sıcaklığında 1 dakika süreyle 11.000 g değerinde santrifüje tabi tutun.
➠➠ Tek kullanımlık Toplama Tüpünü atın Spin Kolonları yeni Toplama Tüplerine yerleştirin.
8.3.6
Spin Kolonları Yıkama
➠➠ Spin Kolonun içine 500 μl Tampon W1 uygulayın.
➠➠ Tek kullanımlık Toplama Tüpünü atın ve Spin Kolonu yeni Toplama Tüpüne geri koyun.
➠➠ Spin Kolonun içine 600 μl Tampon W2 uygulayın.
➠➠ Tek kullanımlık Toplama Tüpünü atın ve Spin Kolonu yeni Toplama Tüpüne yerleştirin.
8.3.7
Spin Kolonları Kurutma
➠➠ Membranı tamamen kurutmak için, oda sıcaklığında 1 dakika süreyle 11.000 g değerinde
santrifüje tabi tutun.
!
Etanol izlerini yok etmek için bu adımın uygulanması gereklidir. Tampon W2 içindeki etanol, enzimatik
reaksiyonları inhibe eder, bu nedenle DNA elüsyonundan önce tamamen yok edilmelidir.
18
8.3.8
DNA elüsyonu
Önceden ısıtılmış (70 °C) Tampon E kullanın!
!
Pipetleme adımları sırasında sıcaklık kaybını önlemek için, 1,5 veya 2,0 ml'lik reaksiyon tüplerinin maksimum
1.300 μl Tampon E ile doldurulması tavsiye edilir (n = 12 numune için yeterlidir).
➠➠ Spin Kolonu, 1,5 ml'lik temiz bir reaksiyon tüpüne yerleştirin.
➠➠ Spin Kolonun içindeki membranın merkezine önceden ısıtılmış (70 °C) Tampon E uygulayın.
➠➠ Kapağı kapatın ve oda sıcaklığında 1 dakika süreyle inkübe edin.
➠➠ 1 dakika süreyle 11.000 g değerinde santrifüje tabi tutun.
!
Downstream uygulamalarında izole edilmiş DNA'dan en iyi performansı almak için sağlanan Tampon E ile
elüsyon tavsiye edilir. Ekstrakte edilen DNA'yı, -20 °C'de saklayın.
oCheck® ürün serisiyle yapılacak deneylerden daha fazla analiz almak için ilgili Kullanım Talimatlarına
başvurun (PapilloCheck®, PapilloCheck® high-risk ve PelvoCheck® CT/NG).
19
9. KURULUM VE ÇALIŞTIRMA KILAVUZU
oCheck® VAC SET VE oCheck® VAC PUMP
oCheck® Vakum Manifoldu, nükleik asitlerin oCheck® DNA Ekstraksiyon Kiti - 8 Kolon Preparasyonu
kullanılarak manüel olarak hızlı bir şekilde paralel saflaştırılması için tasarlanmıştır. Bu sistem,
yüksek kaliteli nükleik asitlerin hızlı bir şekilde eş zamanlı olarak saflaştırılmasını sağlar. Vakum
kullanılması sayesinde, zaman alan santrifüj ve aktarma işlemlerinin uygulanmasına gerek kalmaz.
oCheck® DNA Ekstraksiyon Kitleri, ultra filtrasyon teknolojisi tabanlıdır ve nükleik asit saflaştırma
işlemlerinde hızlı ve kullanışlı bir yol sağlar.
oCheck® DNA Ekstraksiyon Kiti - 8 Kolon Preparasyonunu vakum altında kullanırken, oCheck®
VacSet (Kat. No. 863 080) ve oCheck® VacPump (Kat. No. 863 070) ürünlerinden yararlanılması
önerilir.
9.1
Ürün İçeriği
9.1.1
oCheck® VacSet
9.1.2
Mikrotüp Rafı
Kolon Tutucu
Kör Şeritler (12 adet)
Manifold Kapağı
Aralayıcılar
Manifold Tabanı
Atık Kapları
Vakum Regülatörü
Şekil 2: oCheck® VacSet'in içeriği
20
9.1.3
oCheck® VacPump
oCheck® VacPump
Bağlantı Tüpleri
Susturucu
Şekil 3: oCheck® VacPump'ın içeriği
21
9.2
oCheck® VacSet'in Montajı
➠➠ Manifold Tabanını güvenli bir laboratuvar tezgahının üzerine yerleştirin. Vakum Manifoldu,
şekil 4 a+b'de gösterildiği gibi hazırlanmalıdır.
Bağlama Şeritleri
içeren Kolon Tutucu
Bağlama Şeritleri
Manifold Kapağı
Manifold Kapağı
Atık Kabı
Mikrotüp Rafı
Manifold Tabanı
„Microtube Rack“
Aralayıcı
„Round-Well Block“
Aralayıcı
Manifold Tabanı
Manifold Valfi
Şekil 4: a) DNA bağlama ve yıkama için kurulum 9.2.1
b) DNA elüsyonu için kurulum
DNA bağlama ve yıkama için kurulum
➠➠ DNA bağlama ve yıkama prosedürleri için (protokol adımları 10.3.5 - 10.3.7), Vakum Manifoldunu,
şekil 4a'da gösterildiği gibi kurun.
➠➠ Manifold Tabanının içine bir veya iki Atık Kabı* yerleştirin.
➠➠ Manifold Tabanını Manifold Kapağıyla kapatın.
➠➠ Kolon Tutucuyu Manifold Kapağının kauçuk korumasının içine doğru yerleştirin.
➠➠ Kolon Tutucuya yeterli miktarda Bağlama Şeridi yerleştirin.
➠➠ Bağlama Şeritlerinin doğru bir şekilde takıldığından ve Kolon Tutucuyu sıkıca kapattığından
emin olun (net bir “klik” sesi duymalısınız). Bir seferde 48'den daha az numune işlem görüyorsa,
tutucunun içine yalnızca gereken miktarda Bağlama Şeridi yerleştirin ve Kolon Tutucuda kalan
yerleri, uygun miktarda Kör Şerit ile doldurun.
!
Vakum uygulamadan önce, Bağlama Şeritlerinin ve Kör Şeritlerin, Kolon Tutucuya düzgün bir şekilde
oturduğundan emin olun.
* Atık Kabını temizlemek amacıyla bulaşık makinesine koymayın!
22
9.2.2
DNA elüsyonu için kurulum
DNA elüsyon adımları için (protokol adımı 10.3.8), Vakum Manifoldu, şekil 4 b'de gösterildiği gibi
değiştirilmelidir.
➠➠ Kolon Tutucuyu Bağlama Şeritleriyle birlikte alın ve temiz bir Kağıt Yaprağının (kitle verilen)
üzerine yerleştirin.
➠➠ Manifold Kapağını kaldırın ve kullanılmış Atık Kabını çıkartın.
➠➠ Manifold Tabanının kısa kenarlarına, “Yuvarlak Kuyucuklu Blok” Aralayıcılarını ve üzerine
Mikrotüp Rafını yerleştirin (şekil 4b).
➠➠ Mikrotüp Rafını Aralayıcıların üzerine yerleştirin.
➠➠ Mikrotüp Rafının 2 numaralı sırasından başlayarak, her 2. sıraya etiketlenmiş PCR tüplerinden
gereken miktarda yerleştirin.
➠➠ Vakum Manifoldunu kapatın ve üzerine Bağlama Şeritlerini yerleştirin. Her bir Bağlama
Şeridinin elüe edilen DNA'yı toplayacak PCR tüpünün tam üzerine yerleştiğinden emin olun
(şekil 4c). Tüm Bağlama Şeritleri ve Kör Şeritlerin, Kolon Tutucuya hala düzgün bir şekilde
oturup oturmadığını yeniden kontrol edin.
Şekil 4c: Her bir Bağlama Şeridi kolonunun, doğrudan PCR şeridindeki bir PCR tüpü üzerine yerleştirilmiş olması gereklidir.
23
9.3
oCheck® VacPump'ın Montajı
oCheck® VacPump'ı sabit bir laboratuvar tezgahının üzerine yerleştirin. oCheck® VacPump şekil
5a'da gösterilen şekilde monte edilmelidir. oCheck® VacPump'ı Vakum Manifolduna birleştirmek
için, ekteki iki Bağlantı Tüpünden uzun olanını kullanın. Kısa olan Bağlantı Tüpünü iki parçaya
kesin (yaklaşık 5 cm ve 4 cm). 5 cm'lik Bağlantı Tüpünü oCheck VacPump'ı Vakum Regülatörüne
bağlamak için kullanın. Susturucuyu, 4 cm'lik Bağlantı Tüpünü kullanarak, oCheck® VacPump'ın
çıkışının zıt yönünde sabitleyin.
Susturucuyu buraya
sabitleyin
Manifold Valfi
Şekil 5: a) oCheck® VacPump'ın Montajı
9.4
Ayar Vidası
b) Vakum Regülatörü
Vakumu kurma
Manifold Kapağının, Kolon Tutucunun ve Bağlama Şeritlerinin doğru bir şekilde yerleştirildiğinden
emin olun. Manifold Valfini kapatın (şekil 5a). Vakum Pompasını çalıştırın. Vakumu, Vakum
Regülatörünü kullanarak, kit protokolüne göre ayarlayın (şekil 5b). İstenen vakum seviyesine
ulaşana kadar Ayar Vidasını açın.
9.5
Vakum Uygulama
Numuneleri, bağımsız Bağlama Şeritlerine yükleyin. Manifold Valfini açın ve gerekiyorsa, akış
başlayana kadar Bağlama Şeritlerine hafifçe baskı uygulayın
9.6
Manifoldu havalandırın
Numuneler Bağlama Şeritlerinin filtresinden geçtiğinde Manifold Valfini kapatın ve Vakum
Pompasını durdurun. Kolon Tutucu ile Bağlama Şeritleri kolaylıkla çıkarılabilecek düzeye gelene
kadar yaklaşık 30 saniye bekleyin.
24
10. 8 KOLON PREPARASYONU (Kat. No. 515 050)
10.1
Çalışma solüsyonlarının preparasyonu ve saklama koşulları
Tüm kit komponentleri, oda sıcaklığında (18-25 °C) saklanmalıdır. Komponentler, üretildikten
sonra iki yıl süreyle stabildir.
oCheck® DNA Ekstraksiyon Kiti protokolüne başlamadan önce, aşağıdaki solüsyonları hazırlayın:
1. Proteinaz K, solüsyonu: Kitin ilk kullanımından önce, liyofilize Proteinaz K'nın çözünmesi için
3,35 ml Proteinaz Tamponu (PKB) ekleyin. Solüsyonu alikuotlara bölün ve 6 aya kadar -20
°C'de saklayın. Tekrar dondurmayın.
2. Tampon W2: 200 ml etanolü (p.a. ≥ %99,8), Tampon W2 konsantratına ekleyin. Şişenin etiketine
güncel tarihi not edin. Tampon W2, oda sıcaklığında (18-25 °C) bir yıla kadar stabildir.
3. Tampon L4: Tampon L2'yi Reaktif L3'e tamamen aktarın ve iyice karıştırın. Şişeyi, kitle birlikte
verilen L4 etiketiyle etiketleyin. Şişenin etiketine güncel tarihi not edin. Elde edilen Tampon L4,
oda sıcaklığında (18-25 °C) bir yıl süreyle stabildir.
4. Taşıyıcı RNA solüsyonu: Liyofilize edilmiş Taşıyıcı RNA'nın çözünmesi için, 900μl Tampon
L1 ekleyin. Çözünen Taşıyıcı RNA'yı alikuotlara ayırın, örneğin 16 ekstraksiyon için 50 μl'lik
alikuotlar gibi. Taşıyıcı RNA solüsyonunu -20° C'de saklayın. Tekrar dondurmayın! Kullanılmış
flakonlar çözündüklerinde imha edilmelidir.
Özellikle düşük sıcaklıklarda saklama sırasında, Tampon L1, L2 veya L4'te beyaz bir çökelti oluşabilir.
Bu çökeltiler, kullanımdan önce şişenin 50-70 °C'de inkübe edilmesiyle kolaylıkla çözünebilir.
25
10.2 Numune preparasyonu
10.2.1
PapilloCheck® ve PapilloCheck® high-risk için numune preparasyonu
• PapilloCheck® Toplama Kiti (Greiner Bio-One; Kat. No. 465.070)
• PreservCyt® toplama ortamı (Hologic, Bedford, MA, ABD)
içinde toplanan servikal smear numuneleri, doğrudan işlenebilir.
•
SurepathTM toplama ortamı (BD, Franklin Lakes, NJ ABD) içinde toplanan servikal smear
numuneleri kullanılmadan önce yıkanmalıdır: 250 μl numuneyi, 5 dakika süreyle 11.000 g
değerinde santrifüje tabi tutun ve pelleti 250 μl seyreltilmiş suda yeniden süspansiyon haline
getirin.
•
STMTM toplama ortamı (Qiagen, Hilden, Almanya) içinde toplanan servikal smear numuneleri,
seyreltilmiş suyla seyreltilmelidir: 100 μl numune + 150 μl seyreltilmiş su.
!
Genel olarak servikal smear numunesi çok konsantre ise ve zaten agrege olmuşsa, ekstraksiyona
başlamadan önce numunenin seyreltilmesi ve homojenize edilmesi gerekir!
Çok seyreltilmiş ve gözle görünür hücreleri göstermeyen servikal smear numuneleri, ekstraksiyon için daha
fazla hücre verimi elde etmek amacıyla konsantre edilmelidir. En fazla 1000 μl numuneyi, 5 dakika süreyle
11.000 g değerinde santrifüje tabi tutun ve pelleti 250 μl seyreltilmiş suda yeniden süspansiyon haline getirin.
Bu konsantrasyon adımı, yalnızca PapilloCheck® Toplama Kiti, PreservCyt® toplama ortamı veya
SurepathTM toplama ortamı ile toplanan servikal smear numuneleri için uygulanır. Eğer STMTM toplama
ortamı kullanılmışsa, santrifüj yoluyla konsantrasyon elde edilmesi mümkün değildir.
➠➠ 250 μl numune solüsyonu, 1,5 ml veya 2 ml'lik reaksiyon tüpüne pipetleyin. Kontaminasyonu
önlemek için, lizis adımlarında kullanılan emniyet kapaklı veya vidalı kapaklı reaksiyon tüplerini
kullanın.
Her bir DNA ekstraksiyon döngüsündeki tüm DNA izolasyon prosedürünün, negatif numune kontrolü
kullanılarak valide edilmesi tavsiye edilir.
26
10.3 Standart protokol
Vakum altında oCheck® DNA Ekstraksiyon Kiti - 8 Kolon Preparasyonu kullanılırken uygun bir vakum
sistemi gereklidir. Gereken ekipmanlar, kurulum ve çalışma talimatları, bölüm 9'da açıklanmaktadır.
10.3.1 Preparasyon
➠➠ Santrifüjü oda sıcaklığına (18-25 °C) ayarlayın.
➠➠ Numuneleri bölüm 10.2'ye göre hazırlayın
➠➠ Termoblokları veya su banyolarını, sırasıyla 56 °C ve 70 °C'ye ayarlayın.
➠➠ Elüsyondan önce, elüsyon Tamponu E'yi, 70 °C'de inkübe edin.
➠➠ Çalışma solüsyonlarının bölüm 10,1'e göre hazırlanmasına dikkat edin.
10.3.2 Ön Lizis
➠➠ Liyofilize edilmiş 80 μl Tampon L1 ekleyin.
➠➠ Hazırlanan Taşıyıcı RNA solüsyonundan 2,4 μl ekleyin.
➠➠ 20 μl Proteinaz K solüsyonu ekleyin.
➠➠ Kapağı kapatın ve puls vorteks uygulayarak kısa bir süre karıştırın.
!
Birçok numune işleniyorsa, Proteinaz K, Tampon L1 ve Taşıyıcı RNA kullanılmadan önce karıştırılmalıdır.
Numuneye eklenmeden önce, Tampon L1 ve Proteinaz K'yı kesinlikle 10-15 dakikadan daha fazla
karıştırmayın. Proteinaz K substrat olmadan Tampon L1 içinde kendi kendine parçalanabilir.
➠➠ En az 30 dakika süreyle 56 ºC'de inkübe edin. Numuneleri, bir termo mikser yardımıyla
650 rpm'de sallayın. Bir termoblok veya su banyosu kullanılıyorsa, numuneleri inkübasyon
periyodu süresince arada bir vorteksleyin.
10.3.3 Lizis
➠➠ Kapağı kapatın ve puls vorteks uygulayarak 10 saniye karıştırın.
➠➠ 15 dakika süreyle 70 ºC'de inkübe edin.
➠➠ Kapakların kazara açılmasını önlemek için, reaksiyon tüplerinin ağızlarını sıkıca kapatın.
10.3.4 DNA bağlama şartlarını ayarlama
➠➠ Numuneye 300 μl etanol (p.a. ≥ %99.8) ekleyin.
➠➠ Kapağı derhal kapatın ve puls vorteks uygulayarak 15 saniye karıştırın.
27
10.3.5 DNA Bağlama
➠➠ oCheck® Vakum Manifoldunu şekil 6'ya göre hazırlayın (daha ayrıntılı açıklama için bkz.
bölüm 9).
Bağlama Şeritleri
Manifold Kapağı
Atık Kabı
Manifold Tabanı
Manifold Valfi
Şekil 6: DNA bağlama ve yıkama için kurulum
➠➠ Manifold Tabanının içine bir veya iki Atık Kabı* yerleştirin.
➠➠ Manifold Tabanını Manifold Kapağı ile kapatın.
➠➠ Kolon Tutucuyu Manifold Kapağının kauçuk korumasının içine doğru yerleştirin.
➠➠ Kolon Tutucuya gerekli miktarda Bağlama Şeridi takın. Bağlama Şeritlerinin düzgün bir
şekilde takıldığından ve Bağlama Şeritlerinin Kolon Tutucuyu sıkıca kapattığından emin olun
(net bir “klik” sesi duymalısınız). Bir seferde 48'den daha az numune işlem görüyorsa, tutucunun
içine yalnızca gereken miktarda Bağlama Şeridi yerleştirin ve Kolon Tutucuda kalan yerleri,
yeterli miktarda Kör Şerit ile doldurun.
!
Vakum uygulamadan önce Bağlama Şeritlerinin ve Kör Şeritlerin Kolon Tutucuya doğru bir şekilde
oturduğundan emin olun.
* Atık Kabını temizlemek amacıyla bulaşık makinesine koymayın!
28
➠➠ Bağlama Şeritlerinin kuyucuklarına 900 μl lizat pipetleyin ve kuyucuk alanlarının ıslanmamasına
dikkat edin (şekil 7).
Şekil 7: Lizatı, Bağlama Şeritlerinin kuyucuklarına pipetleyin
➠➠ Vakumu, vakum regülatörü yardımıyla -200 mbar değerine ayarlayın (şekil 8a).
➠➠ Tüm lizatlar kolonlardan geçene kadar, Manifold Valfini açarak yavaş yavaş vakum uygulayın
(şekil 8b).
Ayar Vidası
Şekil 8: a) Vakum Regülatörü Manifold Valfi
b) Manifold Valfi
➠➠ Tüm sıvı kolonlardan geçtikten sonra, vakumu doğrudan durdurun (yaklaşık 30 saniye).
Manifold Valfini kapatarak köpük oluşumunu önleyin.
➠➠ Vakum Pompasını kapatın ve vakumu bırakın.
29
10.3.6 Bağlama Şeritlerini Yıkama
Aşağıdaki adımlar için 8 kanallı pipet ve reaktif rezervuarlarının kullanılması tavsiye edilir (reaktif
rezervuarları kullanılıyorsa, gereken tampon hacimleri için bkz. tablo 1).
Tampon rezervuarları kullanılıyorsa, gerekli miktarda tampon solüsyonu hazırlayın
Ekstrakte
edilecek
numunelerin
sayısı
8
16
24
32
40
48
Tampon W1
6,5 ml
12 ml
17,5 ml
23 ml
28,5 ml
34 ml
Tampon W2*
16 ml
32 ml
48 ml
64 ml
80 ml
96 ml
Tablo 1: n = x numuneler için gereken miktarda tampon solüsyonları
* İlk kullanımdan önce 200 ml etanol ekleyin (ayrıca bkz. bölüm 10.1).
➠➠ Bağlama Şeritlerinin her bir kuyucuğuna 600 μl Tampon W1 ekleyin (şekil 9 a+b).
Şekil 9: a) Tampon rezervuarından Tampon W1 pipetleme. b) Bağlama Şeritlerinin kuyucuklarına Tampon W1 ekleme.
➠➠ Vakumu, Vakum Regülatörü yardımıyla -200 mbar değerine ayarlayın.
➠➠ Tüm lizatlar kolonlardan geçene kadar, Manifold Valfini açarak yavaş yavaş vakum uygulayın
(şekil 8).
➠➠ Tüm sıvı kolonlardan geçtikten sonra (yaklaşık 30 saniye), köpük oluşumunu önlemek için
Manifold Valfini kapatarak vakumu doğrudan durdurun.
➠➠ Bağlama Şeritlerinin her bir kuyucuğuna 900 μl Tampon W2 ekleyin.
➠➠ Tampon kolonlardan geçene kadar (yaklaşık 30 saniye)).
➠➠ vakum uygulayın. Tüm sıvı kolonlardan geçtikten sonra (yaklaşık 30 saniye), köpük oluşumunu
önlemek için Manifold Valfini kapatarak vakumu doğrudan durdurun.
➠➠ Bağlama Şeritlerinin her bir kuyucuğuna 900 μl Tampon W2 ekleyin.
➠➠ Tüm tampon kolonlardan geçene kadar (yaklaşık 30 saniye).
➠➠ vakum uygulayın. Tüm sıvı kolonlardan geçtikten sonra (yaklaşık 30 saniye), köpük oluşumunu
önlemek için Manifold Valfini kapatarak vakumu doğrudan durdurun.
30
10.3.7 Bağlama Şeritlerini Kurutma
➠➠ Son yıkama adımından sonra vakumu durdurun ve Vakum Manifoldunu havalandırın (bölüm
9.6). Kolon Tutucuyu Bağlama Şeritleri ile birlikte çıkarın. Bu arada, Manifold Kapağını açın,
kullanılmış Atık Kabını çıkarın ve yerine kullanılmamış (temiz) bir atık kabı yerleştirin.
➠➠ Manifold Kapağını Kolon Tutucu ve Bağlama Şeritleri ile birlikte Manifold Tabanına yerleştirin.
Manifold Kapağının tekrar sıkıca kapandığından ve tüm Bağlama Şeritleri veya Kör Şeritlerin
doğru bir şekilde oturduğundan emin olun.
➠➠ Membranın tamamen kuruması için maksimum (en az ~400 ila ~600 mbar basınç farkı) değerde
10 dakika süreyle vakum uygulayın.
!
Etanol izlerini yok etmek için bu adımın uygulanması gereklidir. Tampon W2 içindeki etanol, enzimatik
reaksiyonları inhibe eder, bu nedenle DNA elüsyonundan önce tamamen yok edilmelidir.
10.3.8 DNA Elüsyonu
Sonraki elüsyon adımları için Vakum Manifoldunun şekil 10'a göre değiştirilmesi gereklidir.
Bağlama Şeritleri
Manifold Kapağı
Mikrotüp Rafı
„Microtube Rack“
Aralayıcı
„Round-Well Block“
Aralayıcı
Manifold Tabanı
Şekil 10: DNA elüsyonu için kurulum
➠➠ Kolon Tutucuyu Bağlama Şeritleri ile birlikte alın ve temiz bir Kağıt Yaprağının (kitle verilen)
üzerine yerleştirin.
➠➠ Manifold Kapağını açın ve kullanılmış Atık Kabını çıkartın.
➠➠ Manifold Tabanının kısa kenarlarına, “Yuvarlak Kuyucuklu Blok” Aralayıcılarını ve üzerine
Mikrotüp Rafını yerleştirin (şekil 10).
➠➠ Mikrotüp Rafını Aralayıcıların üzerine yerleştirin.
➠➠ Mikrotüp Rafının 2 numaralı sırasından başlayarak, her 2. sıraya etiketlenmiş PCR tüplerinden
uygun miktarda yerleştirin.
➠➠ Vakum Manifoldunu kapatın ve üzerine Bağlama Şeritlerini yerleştirin. Her bir Bağlama
Şeridinin elüe edilen DNA'yı toplayacak PCR tüpünün tam üzerine yerleştiğinden emin olun
(şekil 11). Tüm Bağlama Şeritleri ve Kör Şeritlerin Kolon Tutucuya hala düzgün bir şekilde
oturup oturmadığını kontrol edin.
31
Şekil 11: Her bir Bağlama Şeridi kolonunun, doğrudan PCR şeridindeki bir PCR tüpü üzerine yerleştirilmiş olması gereklidir.
➠➠ Tek kanallı pipet kullanarak, doğrudan her bir Bağlama Şeridi üzerine,) önceden ısıtılmış
100 ml (70 °C) Tampon E pipetleyin. Her bir numune için yeni bir uç kullanılmalıdır.
➠➠ 5 dakika süreyle oda sıcaklığında inkübe edin.
➠➠ Manifold Valfini açarak maksimum -400 mbar değerinde vakumu yavaşça uygulayın.
➠➠ Köpük oluşumunu önlemek için, tüm sıvı kolonlardan geçtikten sonra Manifold Valfini doğrudan
kapatarak vakumu hemen durdurun.
➠➠ Etiketlenmiş PCR tüplerini saklamak üzere kapatın.
!
Downstream uygulamalarında izole edilmiş DNA'dan en iyi performansı almak için sağlanan Tampon E ile
elüsyon tavsiye edilir. Ekstrakte edilen DNA'yı, -20 °C'de saklayın.
oCheck® ürün serisiyle yapılacak deneylerden daha fazla analiz almak için ilgili Kullanım Talimatlarına
başvurun (PapilloCheck® ve PapilloCheck® high-risk)
32
11. SORUN GİDERME
Sorun ve sebebi
Açıklamalar ve öneriler
DNA VERİMİ YOK VEYA
ÇOK DÜŞÜK
Lizis işlemi tamamlanmadı
•Numune iyice homojenize edilmemiş ve Tampon L1 / Proteinaz K ile karıştırılmamıştır.
Karışımın, Tampon L1 eklendikten hemen sonra kuvvetlice vortekslenmesi
gereklidir.
•Numunede yeterli hücre sayısı yoktur.
•Düşük Proteinaz K etkinliği: Solüsyonu alikuotlara bölün ve 6 aya kadar -20 °C'de
saklayın. Tekrar dondurmayın.
Reaktifler doğru bir
şekilde uygulanmadı
•Bölüm 8.1 veya 10.1'e göre Tampon L4, W2, Taşıyıcı RNA ve Proteinaz K solüsyonu
hazırlayın. Lizatları kolonlara yüklemeden önce etanol ekleyin.
Kolondan alınan DNA
elüsyonu yetersiz
•Elüsyondan önce Tampon E'yi 70 °C'ye kadar önceden ısıtın. Silika membranın
merkezine doğrudan Tampon E uygulayın.
•Elüsyon, pH < 7,0 değerinde tamponlarla yapılmışsa, elüsyon önemli ölçüde verim
kaybeder. Tampon E (pH 8,5) gibi hafif alkalin elüsyon tamponları kullanın.
KOLONLAR TIKALI
Lizis işlemi tamamlanmadı
!
Reaktifler doğru bir
şekilde uygulanmadı
•Numune iyice homojenize edilmemiş ve Tampon L1 / Proteinaz K ile karıştırılmamıştır.
Karışımın, Tampon L1 eklendikten hemen sonra kuvvetlice vortekslenmesi
gereklidir.
•Düşük Proteinaz K etkinliği: Solüsyonu alikuotlara bölün ve 6 aya kadar -20 °C'de
saklayın. Tekrar dondurmayın.
•Bölüm 8.1 veya 10.1'e göre Tampon L4, W2, Taşıyıcı RNA ve Proteinaz K solüsyonu
hazırlayın. Lizatları kolonlara yüklemeden önce etanol ekleyin.
ENZİMATİK
REAKSİYONLARDA DNA
PERFORMANSI YETERSİZ
Etanol veya tuz taşınması
•DNA elüsyonundan önce tüm etanolik Tampon W2'nin temizlenmesi için en az
1 dakika süreyle 11.000 g değerinde santrifüje tabi tutulduğundan emin olun.
Herhangi bir sebeple, Tampon W2 kurutma sonrasında kolon çıkışına kadar
ulaşmışsa, santrifüj işlemini tekrar edin.
•Kullanımdan önce Tampon W2'yi soğutmayın. Soğuk tampon tuzu etkili bir şekilde
temizlemez. Tampon W2'yi kullanmadan önce oda sıcaklığına getirin.
DNA'nın inhibe
edici maddelerle
kontaminasyonu
•DNA'yı TE tamponuyla elüe etmeyin. EDTA enzimatik reaksiyonları inhibe edebilir.
DNA'yı yeniden saflaştırın ve Tampon E ile elüe edin.
•Elüatın A260/280 oranı 1,6 değerinin altındaysa, saflaştırma prosedürünü tekrar
edin: Elüata 1 hacim Tampon L4 ve 1 hacim etanol (%96-100) ekleyin. Karışımı spin
kolona yükleyin ve standart protokoldeki DNA bağlama adımına devam edin (bölüm
8.3.5 veya 10.3.5).
33
12. TEKNİK YARDIM
Greiner Bio-One, moleküler biyoloji ve oCheck® ürünlerinde kapsamlı uygulama ve teori deneyimi
edinmiş uzman bilim adamlarından oluşan bir Teknik Servis Departmanına sahiptir.
oCheck® ürünleriyle ilgili herhangi bir sorunuz veya sorununuz olduğunda, lütfen yerel Greiner BioOne distribütörünüze başvurmaktan çekinmeyin.
13. PERFORMANS ÖZELLİKLERİ
oCheck® DNA Ekstraksiyon Kiti, oCheck® ürün serisi ile yapılacak deneylere yönelik bir IVD
aksesuarıdır. oCheck® DNA Ekstraksiyon Kitinin analitik ve spesifik performansı, ilgili deneylerle test
edilmiştir. Performans ile ilgili ayrıntılı açıklama için lütfen oCheck® ürünleri Kullanım Kılavuzuna
başvurun [PapilloCheck® (Greiner Bio-One; Kat. No. 465 060), PapilloCheck® high-risk (Greiner
Bio-One; Kat. No. 505 060) ve PelvoCheck® CT/NG (Greiner Bio-One; Kat. No. 504 002)].
34
14. KISA PROTOKOLLER
DNA Ekstraksiyon
Oda 1
14.1 Tek Kolon Preparasyonu (Kat. No. 515 040)
için kısa protokol
oCheck® DNA Ekstraksiyon Kiti Tek Kolon Preparasyonu
(Greiner Bio-One; Kat. No. 515.040) kullanılarak DNA Ekstraksiyonu
1. PREPARASYON
➠➠
➠➠
➠➠
➠➠
➠➠
➠➠
K
I
S
A
Santrifüjün oda sıcaklığına (18-25 °C) ayarlandığından emin olun
Bölüm 8.1'e göre çalışma solüsyonlarını hazırlayın
Termoblokları veya su banyolarını 56 °C ve 70 °C'ye ayarlayın
Elüsyon Tamponu E'yi önceden 70 °C'ye kadar ısıtın
Numuneleri bölüm 8.2'ye göre hazırlayın
1,5 veya 2.0 ml'lik reaksiyon tüpüne 250 μl numune pipetleyin
2. ÖN LİZİS
➠➠
➠➠
➠➠
➠➠
➠➠
➠➠
80 µl Tampon L1
2.4 μl Taşıyıcı RNA solüsyonu
20 μl Proteinaz K solüsyonu
Kısa bir süre vorteksleyin!
En az 30 dakika 56 °C'de
Santrifüje tabi tutun!
3. LİZİS
➠➠
➠➠
➠➠
➠➠
P
R
O
T
O
K
O
L
250 µl Tampon L4
15 dakika süreyle 70 °C'de
4. DNA BAĞLAMA ŞARTLARINI AYARLAMA
➠➠ 300 μl etanol
➠➠ Kısa bir süre vorteksleyin
➠➠ Santrifüje tabi tutun
35
DNA Ekstraksiyon
Oda 1
5. DNA BAĞLAMA
➠➠
➠➠
➠➠
➠➠
➠➠
K
I
S
A
Spin Kolonları hazırlayın
450 μl lizat
1 dakika süreyle 11.000 g değerinde
450 μl lizat
6. SPIN KOLONLARI YIKAMA
➠➠
➠➠
➠➠
➠➠
500 μl Tampon W1
600 μl Tampon W2
7. SPIN KOLONLARI KURUTMA
P
R
O
T
O
K
O
L
➠➠ 1 dakika süreyle 11.000 g değerinde santrifüje tabi tutun
8. DNA ELÜSYONU
➠➠ 100 μl Tampon E (önceden 70 °C'ye ısıtılmış)
➠➠ 1 dakika süreyle oda sıcaklığında (18-25 °C)
➠➠ 1 dakika süreyle 11.000 g değerinde
36
DNA Ekstraksiyon
14.2 8 Kolon Preparasyonu
(Kat. No. 515.050) için kısa protokol
Oda 1
oCheck® DNA Ekstraksiyon Kiti - 8 Kolon Preparasyonu.
(Greiner Bio-One; Kat. No. 515 050) kullanılarak DNA Ekstraksiyonu
1. PREPARASYON
➠➠
➠➠
➠➠
➠➠
➠➠
➠➠
K
I
S
A
Santrifüjün oda sıcaklığına (18-25 °C) ayarlandığından emin olun
Bölüm 10.1'e göre çalışma solüsyonlarını hazırlayın
Termoblokları veya su banyolarını 56 °C ve 70 °C'ye ayarlayın
Elüsyon Tamponu E'yi önceden 70 °C'ye kadar ısıtın
Numuneleri bölüm 10.2'ye göre hazırlayın
1,5 veya 2,0 ml'lik reaksiyon tüpüne 250 μl numune pipetleyin
2. ÖN LİZİS
➠➠
➠➠
➠➠
➠➠
➠➠
➠➠
80 µl Tampon L1
2,4 μl Taşıyıcı RNA solüsyonu
20 μl Proteinaz K solüsyonu
En az 30 dakika 56 °C'de
3. LİZİS
➠➠
➠➠
➠➠
➠➠
P
R
O
T
O
K
O
L
250 µl Tampon L4
15 dakika süreyle 70 °C'de
4. DNA BAĞLAMA ŞARTLARINI AYARLAMA
➠➠ 300 μl etanol
➠➠ Kısa bir süre vorteksleyin
➠➠ Santrifüje tabi tutun
37
DNA Ekstraksiyon
Oda 1
5. DNA BAĞLAMA
K
I
S
A
➠➠ Bağlama Şeritlerine 900 μl lizat pipetleyin
➠➠ Vakum uygulayın: -200 mbar*
➠➠ Köpük oluşumundan kaçının!
6. BAĞLAMA ŞERİTLERİNİ YIKAMA
➠➠ 1. yıkama 600 μl Tampon W1
➠➠ 2. yıkama 900 µl Tampon W2
➠➠ 3. yıkama 900 µl Tampon W2
Her bir yıkama adımı için:
➠➠ 30-60 saniye
➠➠ -200 mbar*
➠➠ Köpük oluşumundan kaçının!
P
R
O
T
O
K
O
L
7. BAĞLAMA ŞERİTLERİNİ KURUTMA
➠➠ 10 dakika süreyle -600 mbar'da*
8. DNA ELÜSYONU
➠➠
➠➠
➠➠
➠➠
100 μl Tampon E (önceden 70 °C'ye ısıtılmış)
5 dakika süreyle oda sıcaklığında (18-25 °C)
Vakum uygulayın: -400 mbar*
Köpük oluşumundan kaçının!
* Atmosferik basıncın düşürülmesi: Numune viskozitesine bağlı olarak, filtrasyon süresinin uzatılması veya
vakumun arttırılması (örn. -200 ila – 400 mbar) gerekebilir.
38

oCheck® DNA Ekstraksiyon Kiti Kullanım Talimatları - Greiner Bio-One

Transkript

Benzer belgeler

Rekorlar Kitabına Giren Cinayet Gerçekleri

SGS MRL-LIMS Auto Report Sending Application

Mikrobiyom Çalışmaları

Tanıl KOCAGÖZ - Ankara Mikrobiyoloji Derneği

çip üstü laboratuvar eğitim kiti

laurence jenkell

MİKROBİYAL GENOTİPLENDİRMEDE YENİ TEKNOLOJİLER

Linki ziyaret etmek için tıklayın!

bakterilrin sınıflandırılması