Diyare tanısında MALDI
Transkript
Diyare tanısında MALDI
Diyare tanısında MALDI - TOF MS Yakut Akyön Yılmaz MALDI-TOF MS Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization timeof-flight, Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS) (Matriks ile desteklenmiş lazer dezorpsiyon/iyonizasyon uçuş zamanı kütle spektrometresi) Mikrobiyoloji Uygulamaları Tarihi Gelişim Klinik uygulamada sık kullanılan yöntemler: 33 Mevcut Tanımlama Metodları 4 Modern mikrobiyal taksonomi: proteomiks ve genomiks bacterial cell protein DNA proteome species definition & determination mass fingerprint 100 9476.2 4424.2 Voyager Spec #1=>AdvBC(32,0.5,1.0)=>NF0.7[BP = 4423.9, 2117] 2117.3 genome DNA fingerprint 4861.0 90 80 8823.5 70 5897.8 0 3000 5000 9000 10975.2 10493.9 10110.8 9075.2 9611.5 12271.4 8054.3 8903.3 8383.8 7000 8610.6 7424.9 6786.7 7209.8 6533.3 6137.3 4026.9 4535.6 10 3491.4 20 3132.3 30 4765.4 4738.6 40 6984.6 6271.2 6629.0 50 3311.8 % Intensity 60 11000 13000 Mass (m/z) 5 Günümüzde Klinik Kullanım 24 saatlik kültür Manuel Ön-seçim Otomatize sistem Manuel Ön-seçim yok Direnç Testleri Serolojik Testler Görsel Metodlar PCR MALDI-TOF MS Sadece 2 dakika 4 – 72 saat Mikroorganizma tanımlaması MALDI-TOF MS • MALDI-TOF bakterilerin protein yüklerine bağlı ayrıma giderek tanımlamayı gerçekleştirmektedir. MALDI-TOF MS: Temel Prensipler İyon dedektörü tespit ayırım + + + Hareket alanı + elektrot hızlanma Hızlanma alanı iyonizasyon + + desorpsiyon matriks / analit kristalleri kuyucuk Tam bakteri hücresindeki kütle spektrometresine göre farklı tepe paternlerinin oluşması Pantoea agglomerans Acinetobacter lwofii Burkholderia cepacia Raoultella ornithinolytica Staph.aureus E.coli 4000 m/z 8000 İş akışı 1- Örnek Hazırlığı 1µL CHCA matrix Tek kuyucuk Bakteri Kurumaya bırakılır 1µL-Öze ile Tek koloni alınır 2- Ölçüm Escherichia coli Digestive tract E.coli 3775 <<C:\Dokumente und Einstellungen\m.erhard\Eigene Dateien\AnagnosTec-dc\Zwischenablage\Dokument Banner.txt>> Spec [BP = 3 0 3000 5000 3- Analiz - Tanımlama 7000 10939 8744 9000 Mass (m/z) 11000 11572 11906 9654 10226 9330 10 10608 10347 7980 7863 7092 8450 5931 6837 20 7367 40 30 Veri Analizi 5015 60 50 3581 % Intensity 70 9994 8074 90 80 9453 1648.1 7075 100 13000 Barkod, örnek numarası ile slayt pozisyonu arasındaki bağlantıyı sağlar İş akışı: Adım 1 – Örnek hazırlama VITEK MS-DS slayd 48 pozisyonlu 1µL Matrix solusyon ilave edin Tek bir koloni den seçim ve transferi Kalibrant suşu tek kolonisinden seçimi ve transferi Örnek hazırlama Sarf Malzemeler Hazırlanmış Slayt Cihaza Yükleme Bir defada yüklenebilecek toplam örnek sayısı 4X48= 192 adettir. İş akışı: Adım 2 – Ölçüm Otomatik spektrum okuması ~1 dakika numune kalitesine bağlı proteinlerin ionizasyonu ve moleküler ağırlık ölçümü 3775 <<C:\Dokumente und Einstellungen\m.erhard\Eigene Dateien\AnagnosTec-dc\Zwischenablage\Dokument Banner.txt>> Spec [BP = 3 5000 7000 10939 11000 11906 11572 10608 10347 9000 10226 8450 9330 7863 10 0 3000 9994 7980 20 7367 30 7092 40 6837 50 5931 5015 60 3581 % Intensity 70 9654 80 8744 8074 90 9453 1648.1 7075 100 13000 Mass (m/z) 18 İş akışı : Adım 3 – Analiz - Tanımlama Mikroorganizma tanımlaması Algoritma hesaplaması Veritabanı ile karşılaştırma Miktar MALDI-TOF MS: Temel Prensipler Değer MALDI kaşifleri Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time-Of-Flight Mass Spectrometry 1980‘de geliştirildi : Karas & Hillenkamp _Almanya ve Tanaka et al _Japonya. İlk ticari cihaz 1991 Kimya Nobel ödülü : K. Tanaka 2002 21 Koichi Tanaka: biyolojik makromoleküller Koichi Tanaka § John Fenn, 2002 Kullanım alanları MALDI-MS mikroorganizma analizi için önemli bir tanı aracı MALDI-MS hastalık monitorizasyonu tanısı serum protein profillenmesi Bakteri, maya ve filamentöz mantarların, virus, viral vektörlerin doğru ve hızlı tanımlanması Bakteri, maya ve filamentöz mantarların, virus, viral vektörler ve paraziter yapıların araştırılması Taksonomi ve epidemiyoloji Abiotrophia Bordetella Corynebacterium Fusarium Achromobacter Brettanomyces Cronobacter Acinetobacter Brevibacillus Actinobacillus Lactobacillus Nocardia Propionibacterium Staphylococcus Fusobacterium Lactococcus Obesumbacterium Proteus Stephanoascus Cryptococcus Gardnerella Leclercia Ochrobactrum Prototheca Streptococcus Brevibacterium Cupriavidus Gemella Lecythophora Oerskovia Providencia Suttonella Actinomyces Brevundimonas Debaryomyces Geobacillus Legionella Oligella Pseudoflavonifractor Tatumella Aerococcus Brochothrix Delftia Geotrichum Leifsonia Paecilomyces Pseudomonas Tetragenococcus Aeromonas Budvicia Dermabacter Globicatella Leptotrichia Paenibacillus Psychrobacter Thermoanaerobacterium Aggregatibacter Burkholderia Dermacoccus Gluconobacter Leuconostoc Pantoea Rahnella Trichosporon Alcaligenes Buttiauxella Dietzia Gordonia Parabacteroides Ralstonia Trueperella Alicyclobacillus Campylobacter Edwardsiella Alloiococcus Candida Eggerthella Alternaria Capnocytophaga Eikenella Anaerobiospirillum Cardiobacterium Aneurinibacillus Listeria 753 Tür Granulicatella Lysinibacillus Paracoccus Raoultella Vagococcus Grimontia Macrococcus Parvimonas Rhizobium Veillonella Haemophilus Malassezia Pasteurella Rhodococcus Vibrio Elizabethkingia Hafnia Mannheimia Pectinatus Rhodotorula Virgibacillus Carnobacterium Empedobacter Helcococcus Methylobacterium Pectobacterium Riemerella Weeksella Arcanobacterium Cedecea Enterobacter Helicobacter Microbacterium Pediococcus Rothia Weissella Arcobacter Cellulosimicrobium Enterococcus Histophilus Micrococcus Penicillium Saccharomyces Williopsis Arthrobacter Chryseobacterium Erwinia Kingella Mobiluncus Peptoniphilus Salmonella Xanthomonas Asaia Citrobacter Erysipelothrix Klebsiella Moellerella Peptostreptococcus Serratia Xenorhabdus Aspergillus Cladosporium Escherichia Kloeckera Moraxella Photobacterium Shewanella Yersinia Bacillus Clavibacter Eubacterium Kluyvera Morganella Pichia Sphingobacterium Yokenella Bacteroides Clostridium Ewingella Kocuria Mycobacterium Plesiomonas Sphingobium Zygosaccharomyces Bergeyella Collinsella Facklamia Kodamaea Myroides Porphyromonas Sphingomonas Bifidobacterium Comamonas Finegoldia Kytococcus Neisseria Prevotella Sporobolomyces “MALDI-TOF” “MALDI-TOF” “bacteria” “MALDI-TOF” “fungi” “MALDI-TOF” “virus” “MALDI-TOF” “parasite” 11605 2484 1669 366 121 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez 13.Mayıs.2014 MALDI-MS BAKTERİ Anhalt JP, Fenselau C. Identification of bacteria using mass spectrometry. Anal Chem 1975; 47:219–25. 1660 bakteri izolatının %95.4 doğru tanımlanmış 1 izolat için 6 dakika Maliyet konvansiyonel fenotipik tanımlamanın %22-32 Mayıs 2010 MALDI-TOF %99 Fenotipik yöntem %98 Br J Biomed Sci. 2012;69(2):47-55. Comparison of bacterial identification by MALDI-TOF mass spectrometry and conventional diagnostic microbiology methods: agreement, speed and cost implications. El-Bouri K, Johnston S, Rees E, Thomas I, Bome-Mannathoko N, Jones C, Reid M, Ben-Ismaeil B, Davies AR, Harris LG, Mack D. 928 bakteride cins düzeyinde %99.4 tür düzeyinde %89 5-10 dak ilk sonuçlar 90 dak 96 bakteri 1.79-2.56 pound PLoS One. 2012; 7(3): e32589. Published online 2012 March 16. doi: 10.1371/journal.pone.0032589 PMCID: PMC3306318 Direct Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry Improves Appropriateness of Antibiotic Treatment of Bacteremia Anne L. M. Vlek,* Marc J. M. Bonten, and C. H. Edwin Boel Tür düzeyinde saptama 28.8 saat Uygun antibiyotik başlama oranında %11.3 artış Hızlı ve Doğru Campylobacter Tanımlanması VITEK MS ile Campylobacter türlerinin hızlı ve doğru tanımlanması Sonuçlar: 49 adet Campylobacter jejuni 49 adet Campylobacter coli ve referans suşların tamamı %100 doğrulukla ve 90 dakikadan az bir zamanda tanımlanmıştır. ECCMID 2012 - Rapid and accurate identification of Campylobacters with VITEK MS - Reading et al Poster 2323 Hızlı ve Doğru Salmonella Tanımlanması Salmonella Türlerinin Hızlı Tanısında Kromojenik Besiyeri İle Birlikte “MatrixAssisted Laser Desorption Ionization Time of Flight Mass Spectrometry” Yönteminin Phoenix Otomatize Sistemi ile Kıyaslanması Işın AKYAR Simge CAN Acıbadem Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Üsküdar, İstanbul - TÜRKİYE Acıbadem Labmed Klinik Laboratuvarları, Fahrettin Kerim Gökay Cad. No: 49 Altunizade/Üsküdar, İstanbul - TÜRKİYE 347 Salmonella türü hem Phoenix otomatize sisteminde hem de MALDI-TOF cihazında çalışılmıştır. 2 yöntemin sonuçları birbiri ile %100 uyumludur. Her iki cihazda da tür düzeyinde tanımlama yapılabilmekte, alttür tanımlamaları için konvansiyonel olarak Salmonella antiserumları ile serolojik tiplendirmeye gereksinim duyulmaktadır. Kafkas Univ Vet Fak Derg 19 (2): 325-330, 2013 Haziran 2013 – 13 Mayıs 2014 • 37 Salmonella türleri • 2 Shigella türleri • 9 Campylobacter türleri (5 kan kültürü) – 6 C. jejuni MALDI-TOF Maliyet Etkinlik ve Sonuç Zamanı MALDI-TOF Sonuç Duyarlılığı Gram-pozitif koklar Stafilokok, streptokoklar Enterobacteriaceae Escherichia coli Yersinia enterocolitica Erwinia türleri Salmonella enterica Nonfermentatif bakteriler Campylobacter Helicobacter pylori Aeromonas Haemophilus influenzae Streptococcus pneumoniae Streptococcus agalactiae Bartonella henselae Neisseria, Listeria, mikobakteri Antibiyotik direncinin dakikalar içinde belirlenmesi Avantaj • • • • • • • • • Hızlı Fazla sayıda örnek (96) Maliyet etkin Sarf malzemeleri ucuz Az örnekle çalışılır Maya ve anaerop tanısı koyulabilmekte Parazit ve virus çalışılabilmektedir Güvenilir Rutin ve araştırma için kullanılabilir Dezavantaj • • • • Kurulum pahallı Koloni olmalı Teknik donanım Veriler biyoinformatik programla kısıtlı Teşekkür ederim.