Referans dışı yöntemlerdeki gelişmeler neler sunuyor?
Transkript
Referans dışı yöntemlerdeki gelişmeler neler sunuyor?
Referans Dışı Yöntemlerdeki Gelişmeler Neler Sunuyor? Dilek Yeşim METİN Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji AD, Bornova-İZMİR Antifungal Duyarlılık testleri Antifungal tedavinin doğru yönlendirilebilmesi Klinik yanıtın tahmin edilebilmesi CLSI (Clinical and Laboratory Standarts Institute) Kılavuzları Mayalar-sıvı dilüsyon • 1992 • M27P • 1995 • M27T • 1997 • M27A • 2002 • M27A2 • 2008 • M27A3 • M27S3 Mayalar- disk difüzyon • 2003 • M44P • 2004 • M44A • 2009 • M44A2 • M44S3 Küfler-sıvı dilüsyon • 1998 • M38P • 2002 • M38A • 2008 • M38A2 Küfler-disk dfüzyon • 2009 • M51P • M51S1 • 2010 • M51A The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing” Antifungal Susceptibility Testing (EUCAST-AFST) Dilüsyon temelli Mayalar Küfler EUCAST E.Def 7.2 EUCAST E.Def.9.2 Referans Dışı Yöntemler Dilüsyon Temelli Testler Kolorimetrik dilüsyon testleri •Sensititre YeastOne (TREK Diagnostic Systems Inc.,Westlake, Ohio) •ASYT Kalorimetrik Antifungal Panel (Kyokuto Pharmaceutical Industrial, Japan) •Liofilchem® SensiQuattro Candida EU ((Liofilchem Diagnostics, L’Aquila, Italy) •Candifast Es Twin (ELITech Microbiology Reagents; France) •Integral Yeast Systems Yeasts (Liofilchem Diagnostics, L’Aquila, Italy) •Fungitest (Bio-Rad Laboratories, France) •ATB Fungus 3 (API-bio-Mérieux, Marcy I’Etoile; France) •Mycostandard (Institut Pasteur, Paris, France) •Mycototal (Behring Diagnostic, Rueil-Malmaison, France) Tam otomatize sistemler • Vitek 2 (bio-Mérieux, Marcy I’Etoile; France) Referans Dışı Yöntemler Difüzyon Temelli Testler Gradiyent Strip Test • Etest (bioMérieux, France) • The Liofilchem MIC Test Strips (Roseto degli Abruzzi Italy) Disk Difüzyon /Tablet Difüzyon Test • Neo-Sensitabs tablet (A/S Rosco Diagnostica, Denmark) • Abtek Biological antifungal disks (Abtek Biologicals Ltd., Liverpool, UK) • BBL Sensi-Disc (BD Diagnostics, New Jersey, US) • Fungidisc (Mast Group Ltd., Merseyside, UK) Referans Dışı Yöntemler "Araştırma amaçlı" • • • • • • • Akan hücre ölçer "flow cytometry" MALDİ-TOF İzotermal mikrokalorimetre X-Plate tekniği XTT Ergosterol miktarının tayini Nükleik asit temelli yöntemler Referans Dışı Yöntemler FDA onaylı-Candida kökenleri için Etest (bioMerieux, Marcy l’Etoile, France Sensititre YeastOne (TREK Diagnostic Systems Inc.,Westlake, Ohio); VİTEK 2 (bioMerieux; France) flukonazol itrakonazol vorikonazol flusitozin flukonazol itrakonazol vorikonazol flusitozin kaspofungin flukonazol flusitozin kaspofungin (!) Mikafungin (!) Kullanılan ticari yöntemler 13 6 6 4 Etest Vitek Sensititre DD 1 1 Biorad API ATB Fungus 3 Gradiyent strip test Yüzeyinde tek bir antifungal ilacı, giderek artan oranlarda içeren plastik şeritlerin mantar inokule edilmiş agar plakları üzerine yerleştirilmesini temel alan duyarlılık testi yöntemidir. Gradiyent strip test Etest (bioMérieux, France) The Liofilchem MIC Test Strips (MTS) (Via Scozia, Roseto degli Abruzzi (Te) Italy) Gradiyent strip test (Etest) • 15 dilüsyonluk skala – Amphotericin B (0.002-32 µg/ml) – Anidulafungin (0.002-32 µg/ml) – Caspofungin (0.002-32 µg/ml) – Flukonazol (0.002-32 µg/ml) – Flucytosine (0.002-32 µg/ml) – İtrakonazol (0.002-32 µg/ml) – Ketokonazol (0.002-32 µg/ml) – Posakonazol (0.002-32 µg/ml) – Vorikonazol (0.002-32 µg/ml) Gradiyent strip test Besiyeri • MOPS’la tamponlanmış, %2 glikoz içeren RPMI 1640 besiyeri İnokulum • Candida ve Aspergillus türleri: 0,5 McFarland • C. neoformans ve bazı küfler: 1 McFarland Enkübasyon süresi • Aspergillus ve Rhizopus türleri: 18-24 saat • Candida türleri: 24-48 saat • C. neoformans: 48-72 saat Değerlendirme • Mayalar; azoller için %80, amfoterisin B için %100 olan inhibisyon zonu • Küfler; %100 inhibisyon zonu Gradiyent Strip Test-Sinerji Pankey G et al. Antimicrob Agents Chemother 2014; 58: 5795-5800 • 35 C. glabrata, Polimiksin B ve Flukonazol • BMD Time kill, E test arasındaki uyumsuz sonuçlar kökenlere veya yöntem farklılıklarına bağlı olabilir. • Etest sinerji yöntemi araştırma amaçlı kullanılan bir yöntem. • Time kill yöntemi de standardize değil • Etest yöntemi daha elverişli, kullanımı daha kolay ve tekrar edilebilir. Etest sinerji Etest etkisiz BMD time kill Sinerji BMD time kill Etkisiz 13 6 8 8 Gradiyent Strip Test-Sinerji Time-kill Etest En iyi sinerji kaspofungin+vorikonazol Referans Yöntemlerle Uyum-Mayalar Dannaoui E ve ark. Clin Microbiol Infect. 2010 Referans Yöntem EUCAST AMB FLU ITC VOR 75 71.7 70.7 86.6 25-91 POS CAS ANF 75 - Bourgeois N ve ark. J Clin Microbiol, 2010 CLSI 32-100 Pfaller MA ve ark. L Clin Microbiol. 2010 Espinel Ingrof A ve ark. Antimicrob Agents Chemother. 2010 CLSI - - - - 90.2 93.2 CLSI - - - - - 54-82 88-100 Cuenca-Estrella M ve ark. J Clin Microbiol. 2010 Ranque S ve ark. J Clin Microbiol, 2012 CLSI EUCAST 97.4-96.4 98.4 96.4-95.2 97.2 - 95.2-95.2 95.2 - - CLSI ≥90 Mahabeer Y ve ark. Diagn Microbiol Infect Dis. 2014 CLSI C. neoformans 83.3 95.1 Koehling HL ve ark. J Clin Microbiol, 2015 EUCAST-MTS 60-100 87-100 76.598.5 91.2 - 80-100 92-100 49-100 Referans Yöntemlerle Uyum-Küfler Araujo J ve ark. Antimicrobial Agents Chemother. 2009 Martos AI ve ark. Med Mycol. 2010 Fuller J ve ark J Clin Microbiol. 2010 Pinto E ve ark. Mycopathologia, 2014 Referans Yöntem CLSI Cins/tür Antifungal Uyum A. fumigatus Posakonazol 92 (24 saat) 90 (48 saat) CLSI Aspergillus türleri (A. niger ve A. glaucus dışında) Ekinokandinler 82.4-100 CLSI Aspergillus Kaspofungin CLSI *(MHA) Aspergillus spp (48), Fusarium spp (7), Beauveria bassiana (1) Paecilomyces lilacinus (3) Kaspofungin, anidulafungin, vorikonazol, posakonazol, AmB 18 (MHA) 26 (RPMI) 71.9 (±1) 99.7 (±2) *MHA: Müller Hinton Agar besiyeri Üç yöntemden en az birinde yüksek MİK değerleri gösteren kökenlerde FKS1 ve FKS2 mutasyonu aranmış Amaç C. glabrata’nın (n: 193) KF duyarlılığını 3 yöntemle değerlendirmek Etesti referans yöntemlerle karşılaştırmak MİK değerlerini farklı sınır değerleri ile değerlendirmek Sınır değerler • S ≤ 0.125 mg/l, I = 0.25 mg/l, R≥ 0.5 mg/l (Pfaller ve ark) • S ≤ 0.5 mg/l, R> 0.5 mg/l (Arendrup ve ark.) • Etest: S ≤ 2 mg/l, R > 2 mg/l (üretici önerisi) Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2014; 33: 1247-1252 Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2014; 33: 1247-1252 • ≤0.25 mg/L olan köken • Etest ile %98.4 • CLSI ile %90.7 • EUCAST ile %26.4 • ≤0.5 mg/L olan köken (EUCAST): %93.2 • 16 köken; CLSI (R), Etest (S)= ÇBH 18 kökende FKS1 mutasyonu yok. FKS2 mutasyonu 3 kökende (!) Etest; FKS mutasyonunu saptamada CLSI ve EUCAST kadar başarlılı C. glabrata için önerilen sınır değer; S ≤ 0.5 mg/l, R> 0.5 mg/l (Arendrup ve ark.) 24 saatlik değerlendirmeler başarılı bulunsa da, C. glabrata yavaş ürediği için 48 saatlik değerlendirmeler önerilmektedir. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2014; 33: 1247-1252 "dip-effect" • Düşük konsantrasyonlarda, stribe paralel görülen dar inhibisyon zonu Amaç: • Candida türleri (n: 60), ekinokandinler, MTS (Liofilchem-Roseto degli Abruzzi Italy) X SYO ve CLSI yöntemi değrelendirmek • "dip-effect" görüldüğünde, MİK değerlendirmesi için yeni bir formül geliştirmek Yöntem: • Ekinokandin duyarlılık testleri SYO ve MTS ile yapıldı • "dip-effect" varlığında, Etest ve CLSI J Clin Microbiol. 2015; doi: 10.1128/JCM.02073-15 Dip-effect varlığında MİK değerlendirme • inhibisyon zonunun, stribi kestiği dipeffect’in tabanı (üretici firma önerisi) • Eliptik inhibisyon zonunun tahmini olarak stripi keseceği yer, dip-effect’in üstü • Yeni geliştirilen formülle bulunan değer J Clin Microbiol. 2015; doi: 10.1128/JCM.02073-15 İlaca ve MİK’e bağlı gelişen bir fenomen • Yalnızca kaspofunginde gözleniyor "Plastik striplerden difüzyon sorunu, daha düşük moleküler ağırlığı nedeniyle olabilir" • CLSI MİK ≥ 0.5mg/L ise; "dip-effect" yok Etest ile değerlendirildiğinde, "dip-effect" net değil • Eliptik zon daha uzun, fenomen daha kısa ve stribi kesen açı dar "dip-effect" anlaşılır değilse, duyarlı kökenler yanlışlıkla, dirençli olarak yorumlanabilir. Gradient konsantrasyonları 0.03-1 mg/L; ise • değerlendirme hatalarını önlemek için bu yeni formülasyonla MİK değerlerini hesaplama öneriliyor Gradiyent Strip Test Uygulaması kolay Kontaminasyon kolay farkedilir İnokulum değişikenliklerine tolerans gösterir AmB içim MİK aralığı daha geniş MİK, mantarın üreme hızından etkilenmez Antifungaller arası sinerji çalışılabilir CLSI sınır değerleri kullanıyor. Yönteme uygun KSD/ECV’leri yok Pahalı Okuma-değerlendirme ile ilgili teknik sorunlarla karşılaşılabiliyor Referans yöntemlerle uyumu tür-ilaç kombinasyonuna göre farklılık gösteriyor Küf mantarları için onay yok Sensititre YeastONE Antifungal Duyarlılık Paneli Kolorimetrik mikrodilüsyon yöntemi CLSI sınır değerleri kullanılır Amphotericin B Dilüsyon Aralıkları µg/ml 0.12 - 8 5-Flucytosine 0.06 - 64 Anidulafungin 0.015 - 8 Caspofungin 0.008 - 8 Micafungin 0.008 – 8 Fluconazole 0.12 - 256 Itraconazole 0.015 - 16 Variconazole 0.008 - 8 Pasaconazole 0.008 - 8 Antifungal İlaçlar Dehidrate formda, çift kat dilüsyonlu, 9 antifungal içerir Kolorimetrik son nokta okuması için alamar mavisi indikatörü içerir. Sensititre YeastONE Antifungal Duyarlılık Paneli Mayalar Küfler • İnokulum: 1.5 -8X 103 cfu/ml [0.5 Mc Farland maya süspansiyonu + yeast One buyyon (RPMI1640+%1.5 glikoz)] • Enkübasyon süresi: Candida türleri: 24 saat, C. neoformans: 48 saat • Değerlendirme: Renk değişikliğinin olduğu en düşük konsantrasyon: MİK • İnokulum: 0.5-5 X 104 cfu/ml [0.5 Mc Farland maya süspansiyonu+yeast One buyyon (RPMI1640+%1.5 glikoz)] • Enkübasyon süresi: 48 – 72 saat • Değerlendirme: Renk değişikliğinin olduğu en düşük konsantrasyon: MİK Sensititre YeastONE Antifungal Duyarlılık Paneli En yaygın kullanılan ticari yöntemlerden biri! Kullanıma hazır, tek kullanımlık ambalajlarda, uygulaması kolay, güvenilir Hızlı ve zamanında sonuç verebilen, tekrarlanabilirliği yüksek Sensititre YeastONE Antifungal Duyarlılık Paneli %99.3 Ekinokandinler, Candida türleri için valide edilmiştir. %100 %100 Yüksek düzeyde tekrarlanabilirlik: %99 Sensititre YeastONE Antifungal Duyarlılık Paneli Cins/tür Referans Yöntem CLSI AMB FLC FLU ITC VOR CAS ≥92 ≥92 82 ≥92 85 ≥92 CLSI 24 CLSI 48 EUCAST 97.4 96 97.9 95.2 95.2 96 96 95.6 97.2 - 95.6 95.2 95.5 Alexander BD ve ark. . J Clin Microbiol. 2007 Cuenca-Estrella M ve ark. J Clin Microbiol. 2010 Candida spp (212) Castro C ve ark. J Clin Microbiol. 2004 Guinea J ve ark. Diagnos Microbiol Infect Dis. 2006 Aspergillus spp (63) A.fumigatus CLSI 24 CLSI 48 CLSI72 Patel R ve ark. J Clin Microbiol. 2007 Aspergillus spp (179) Fusarium spp (41) Zygomycetes (29) CLSI Maya - POS 82.5 0 31.5 82.1 86.7 98.3 98.2 92.8 98.3 98.9 97 100 93 Sensititre YeastONE Antifungal Duyarlılık Paneli Dirençli kökenleri saptamada başarılı ve CLSI ile güçlü korelasyon göstermekte Klinik sınır değerler, CLSI’ya dayanır CLSI klinik sınır değerleri, kazanılmış yada mutasyonel direnç kazanan mantarı duyarlı olarak tanımlayabilir J Clin Microbiol. 2013; 51: 2691-2695 J Clin Microbiol. 2012; 50: 3921-3926 857 köken (1 merkez) • SYO için belirlenmiş KSD’ler yok, CLSI önerileri ile • Ekinokandin, AmB ve FC / azoller için Candida türlerinde WT –MİK dağılımını göstermek • Her bir tür-ilaç kombinasyonu için ECV değerleri önermek • Beş farklı yöntemle ve CLSI yöntemi ile elde edilen ECV’leri karşılaştırmak 1995-2010 • C. albicans (334) • C. parapsilosis (315) • C. glabrata (56) • C. tropicalis (62) • C. orthopsilosis (63) • C. krusei (27) 1262 köken (43 merkez) 2009-2010 • C. albicans (610) • C. parapsilosis (327) • C. glabrata (156) • C. tropicalis (113) • C. orthopsilosis (30) • C. krusei (26) J Clin Microbiol. 2013; 51: 2691-2695 J Clin Microbiol. 2012; 50: 3921-3926 CLSI ile SYO MİK/ECV dağılımları uyumlu Avantajı •tedavi öncesi elde edilen kökenlerle çalışılmış Kısıtlılıkları. • tek ülke verisi, • C. krusei ve C. orthopsilosis’in sayıca az olması • direnç mekanizması bilinen köken sayısı az Kalıcı ECV’ler belirlenerek, duyarlılıkları azalmış ya da direnç kazanmış kökenler daha kolay tanımlanır Antimicrob Agents Chemother, 2015; 59: 6725-6732 Amaç:, 9 ülke, 38 bağımsız laboratuvardan, 8 farklı Candida türleri için elde edilen verilerle tür-ekinokandin kombinasyonu için SYO ECV değerleri önermek 81 non-WT, 14 WT (6 laboratuvardan) SYO ECV’ler, modal MİK dağılımlarına göre hesaplandı. SYO-ECV 5 Candida türüne ait, 81 fks mutant kökenleri SYO ECV üç ekinokandin Anidulafungin: 72 (%88.9) non-WT kökenleri74belirlemede Kaspofungin: (%91.4) katkı sağlayabilir. Mikafungin: 76 (%93.8) VITEK 2 • Dilüsyon temelli tam otomatik antifungal duyarlılık sistemi • Eş zamanlı tanımlama • Spektrofotometrik değerlendirme • Daha objektif ve daha kısa sürede – Candida türleri için 9.1-27.1 saat (ortalama 12-14 saat) – Cryptococcus türleri 12.1 saat FDA , 2006 yılında flukonazol direncini saptamada klinik kullanımını onayladı VITEK 2 Antifungal Duyarlılık Kartları Vitek 2 ASTYS01 •Amfoterisin B, Flusitozin, Flukonazol, Vorikonazol Vitek 2 ASTYS02 •Flukonazol Vitek 2 ASTYS06 •Amfoterisin B, Flusitozin, Flukonazol, Vorikonazol, Kaspofungin Vitek 2 ASTYS07 •Amfoterisin B Flusitozin, Flukonazol, Vorikonazol, Kaspofungin, Mikafungin Vitek 2 AF03 IUO yeast Flukonazol Cuenca-Estrella M ve ark. J clin Microbiol, 2010 Bourgeois N ve ark. J Clin Microbiol. 2010 Peterson JF ve ark. J Clin Microbiol. 2011 Melhem MSC ve ark. Brazil J Microbiol. 2013 Mahaber Y ve ark. Diagnost Microbiol Infect Dis. 2014 Figueiredo-Carvalho MHG ve ark. Mycopathologia, 2014 Referans Yöntem CLSI Cins/tür AmB Flu Vori Candida, C. neoformans 99.3 96.6 96.8 98.7 97.5 97.5 CLSI Candida 86.4-100 94.6100 89.6100 CLSI Candida CLSI ve EUCAST Candida 100 100 CLSI C. neoformans 95.1 97.1 CLSI C. Parapsilosis komplex 100 100 EUCAST KF MF 99.5 98.6 100 100 100 205 Candida türü, AmB, flukonazol, vorikonazol Çok büyük hata C. glabrata kökenlerinde C. krusei ve C. glabrata gibi azollere dirençli olabilen kökenler için Vitek sınır değerleri yeniden düzenlenmeli Türe özgü sınır değerler? Ya da EUCAST sınır değerlerinin kullanımı 3 farklı lab, 425 Candida türü Diag Microbiol Infect Dis 2013; 77: 37-40 Vorikonazol ECV wt≤0.5, ≥1 non wt J Clin Microbiol 2014; 52: 2126-30. • Flukonazol dilüsyonları düzenlenmiş, Vitek 2 AF03 IUO yeast (0,5-64 µg/ml) • 86’sı dirençli olan 746 köken • Yeni belirlenmiş türe özgü klinik sınır değerleri • Esas uyum: • Candida türleri %94, C. neoformans %86.4 – C. glabrata %88.4, C. kefyr %66.7 • Kategori uyumu Candida türleri %92, C. neoformans %84.1 C. glabrata Vitek: ≤ 0.25 - ≥ 4 CLSI: ≤ 0.125 (S) 0.25 (I) ≥ 4 (R) CLSI & Vitek Esas uyum: %92.6 fks : %78.6 WT: %98.5 Candida spp (n: 98) [fks mutant (n: 31)] FKS geni "altın standart" Vitek 2 CLSI EUCAST (KF) (KF) (AF) Kategori uyumu: %93.9 Kategori uyumu: %88.4 ÇBH: %3.5 Kategori uyumu: %98.7 ÇBH: %19.4 ÇBH: %3.3 AAC. 2013; 57: 177-182 VITEK 2 Kolay uygulanabilir Erken sonuç verebilen Eş zamanlı tanımlama yapabilen Referans yöntemlerle esas uyumu yüksek Tam otomatize CLSI /EUCAST sınır değerleri ile sonuç Kategori uyumu özellikle yeni sınır değerlerin kullanılması ile düşük Dilüsyon aralıklarının alt sınırı, bazı türler için tanımlanan ECV sınırının üzerinde C. glabrata türleri için tanımlanan sınır değerler dirençli kökenleri tanımlamada yetersiz Akım sitometrisi "flow cytometry" Test edilecek antifungal ilacın çift kat seri dilüsyonları ile işlem görmüş mantar hücrelerinin florokrom boyalarla boyanması ve akım sitometrisinde okutulması ve analiz edilmesi Floresan boyalarla boyanıp boyanmama durumuna göre hasara uğramış veya ölü mantar hücrelerinin hızlı saptanmasına olanak verir. Akım sitometrisi "flow cytometry" Besiyeri İnokulum Enkübasyon süresi ve ısı Değerlendirme • RPMI1640 • 1X106 cfu/ml (en hızlı ve kaliteli okuma için) • Maya hücreleri ve Aspergillus türleri için konidyumlar • 30 dk-24 saat (genellikle 4 saatten kısa), 350C • FC’de özel Software ile • MFEC (Minumum Fluorescence-Enhancing Concentration) • MFEC (Minumum Fluorescence-Enhancing Concentration): Yüksek bir floresan düzeyi ile karşılaştırıldığında, hücrelerin belirli bir yüzdesinde floresan artışı gösteren en düşük ilaç konsantrasyonu • C. glabrata ve C. krusei için %50, C. parapsilosis için %40 Vale-Silva LA, Pinto P, Lopes V, Ramos H, Pinto E. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2012; 31: 941-946 Akan hücre ölçer "flow cytometry" Akan hücre ölçer "flow cytometry" • Sıvı dilüsyon temelli bir yöntem • Araştırma amaçlı kullanılıyor Avantaj: • >10000 hücrenin ayrı analizi yapılır: Test sonuçlarının doğruluğu ve duyarlılığını artırır • Sonuç kısa sürede Dezavantaj: • • • • Maliyeti yüksek, özel ekipman gerektirir Uygun sonuç elde etmek için, deneyimli personel gerekir Standardize edilmeli Tekrar edilebilirlik ve test sonuçlarının klinik ile uyumunun araştırıldığı çalışmalara ihtiyaç var. İzotermal Mikrokalorimetre • Mikroorganizmaların üreme ve metabolizmalarına bağlı olarak üretilen ısının ölçülmesi temeline dayanır. • Duyarlı, kesin ve gerçek zamanlı bir ölçüm sağlar İzotermal Mikrokalorimetre Besiyeri • Sıvı Sabouraud (farklı besiyerleri içinde daha kısa sürede ve daha fazla ısı üretimi) İnokulum • 2.5 x 104conidya/ml (hemasitometre ile) Enkübasyon süresi Değerlendirme • Saat-gün • MHIC (Minimal Heat Inhibitory Concentration) • Analiz: Özel bir software İzotermal Mikrokalorimetre MHIC • AmB ve azoller için: Üreme kontrolünün oluşturduğu toplam ısının %50’sini 48 saatte inhibe eden en düşük ilaç konsantrasyonu • Ekinokandinler için: Üreme kontrolüne göre 48 saatte ısı akış tepesini %50 azaltan en düşük ilaç konsantrasyonu İzotermal Mikrokalorimetre Kalorimetre modülü İzotermal Mikrokalorimetre • Aspergillus türlerinin gerçek zamanlı antifungal duyarlılıklarının belirlenmesinde referans yöntemlerle uyumlu – CLSI MEK ve MHIC ±2 dilüsyonda uyum oranı AmB, vorikonazol ve posakonaol için ≥%90 – Kaspofungin için %70 • Mucorales, Fusarium ve Scedosporium türleri ile yapılan çalışmada CLSI MEK ve MHIC ±2 dilüsyonda uyum oranı – AmB, posakonazol ve kaspofungin için <%90, posakonazol >%90 Tafin UF et al. Clin Microbiol Infect 2012; 18: Tafin UF et al. Diagnost Microbiol Infect Dis. 2012; 73: 330-337 Diag Microbiol Infect Dis 2013; 77: 31-36 • A. fumigatus ATCC 204305 – AmB X Ekinokandin (anidulafungin ve kaspofungin) • A. terreus ATCC 10690 – Vorikonazol X ekinokandin (anidulafungin ve kaspofungin) • Eşit fraksiyonel konsantrasyonlar (0.125X, 0.25X, 0.50 ve 1) • AmB ve vorikonazol, ekinokandinlerle kombine edildiğinde etkinliklerinde artış gözlenmiş • Aspergillus türlerinde gerçek zamanlı sinerjinin değerlendirilmesini sağlıyor • Yöntem Aspergillus türleri ve diğer küf cinslerinin antifungal kombinasyonlarında sinerji için valide edilmesi , hayvan çalışmaları ve klinik çalışmalarla desteklenmesi gerekmektedir. MALDI-TOF-MS Matriks ile desteklenmiş lazer dezorpsiyon/iyonizasyon uçuş zaman kütle spektrometrisi • Mikroorganizmaları, protein yüklerinin ayrımına bağlı olarak tanımlayan bir yöntemdir • Kullanılan iyonizasyon tekniğidir Örnek matriks ile kristalize edilir (iyonizasyonu kolaylaştırmak ve biyomolekülü direkt lazer atışının tahribinden korumak için) Lazer ışını, örnek+matriksin buharlaşmasına neden olur Oluşan iyonlar yüklerine göre ayrılacakları tüp içerisinde hareket ederler Uçuş hızlarına göre ayrılan biyoanalitler bir kütle spektromu oluşturur Proteinler, peptid kütle parmak izi ile tanımlanır MALDI-TOF AFDT 15 saat, seri ilaç konsantrasyonlarına maruz kalan mantarın proteom değişikliklerine dayanan bir yöntemdir. Tüm konsantrasyonlar / üç nokta testi (en yüksek, sınır değer, sıfır değeri) kullanılabilir Composite Correlation Index (CCI) değerleri kullanılıyor Minimal Profile Change Concentration (MPCC): Sıfır konsantrasyona göre maksimum konsantrasyonda izlenene daha yakın spektrumdaki en düşük ilaç konsantrasyonu (CCI değeri) Vella A ve ark. J Clin Microbiol 2013; 51: 2964-69 Saraçlı MA ve ark. Med Mycol 2015; 53: 736-42. MALDI-TOF AFDT Antifungal duyarlılıkların belirlenmesinde güvenilir ve tekrar edilebilir bir yöntem Daha hızlı sonuç (15 saat) İdentifikasyon amacıyla bu teknolojiyi kullanan ve rutin yükü fazla olan laboratuvarlarda kullanılabilecek objektif bir yöntem Aynı anda ve tüm Candida türlerinin farklı ilaç duyarlılıklarını test etmek mümkün CCI tabanlı eşleştirme gibi yazılım algoritmaları üzerinde personel eğitimi gerektirir. Gray- zone tanımı eksik: [CCI: 0.99 (R), CCI: 1.01 (S); arsındaki oran ??? Kalite kontrol prosedürü yok Direnç, proteomik değişiklerle belirlenebiliyor. Proteomik değişiklikler yeteri kadar yüksek değilse saptayamayabilir Vella A ve ark. J Clin Microbiol 2013; 51: 2964-69 Saraçlı MA ve ark. Med Mycol 2015; 53: 736-42. SONUÇ Ticari yöntemler Etest SYO Gelişmekte olan yöntemler FC IMC Vitek 2 Maldi-Tof MS Mantar maya ve küf maya ve küf mayalar Aspergillus türleri sıvı MD Candida ve Aspergillus türleri sıvı dilüsyon sıvı dilüsyon Candida ve Aspergillus türleri sıvı dilüsyon Yöntem agar difüzyon sıvı MD Enkübasyon zamanı (saat) Son nokta okuması 24-48 24-48 12-24 1-7 48 3-15 görsel görsel otomatik floresan mikroskobi IMC kütle spektrometre Trailing üreme var var pahalı Rutin pahalı rutin Uygulanabilirlik Maliyet Kullanım alanı Direnci saptamada hiçbir yok var yok yöntem birbirine üstün değil pahalı rutin ekonomik antifungal direnç saptamada, yalnızca araştırma amaçlı ekonomik antifungal direnç saptamada, yalnızca araştırma amaçlı yok ekonomik antifungal direnç saptamada, yalnızca araştırma amaçlı SONUÇ Ticari yöntemlerle elde edilen sonuçlar CLSI/EUCAST sınır değerleri ile olmakta Referans yöntemlerin sınır değerlerine dayanarak klinik köken, dirençli olarak tanımlanmamalı Yönteme özgü standardizasyon ve klinik sınır değerler belirlenmeli SYO’da başladığı gibi… Yeni yöntemler umut verici, standardize edilmeli, çeşitli tür ve ilaçlarla çalışmalar yapılmalı Teşekkür ederim