øNVERTAZ ENZøMøNøN AFøNøTEYE DAYALI TEKNøK
Transkript
øNVERTAZ ENZøMøNøN AFøNøTEYE DAYALI TEKNøK
I EGE ÜNVERSTES FEN BLMLER ENSTTÜSÜ (YÜKSEK LSANS TEZ ) NVERTAZ ENZMNN AFNTEYE DAYALI TEKNKLER LE SAFLATIRILMASI LKE YÜCEKAN BYOKMYA ANABLM DALI Bilim Dal kodu:405.05.01 Sunu Tarihi:17.07.2008 Tez Danman: Doç. Dr. Seçil ÖNAL Bornova- ZMR 2008 II III Sayn ølke YÜCEKAN tarafndan Yüksek Lisans Tezi olarak sunulan ‘‘øNVERTAZ ENZøMøNøN AFøNøTEYE DAYALI TEKNøKLER øLE SAFLAùTIRILMASI” baúlkl bu çalúma E.Ü.Fen Bilimleri Enstitüsü E÷itim ve Ö÷retim Yönergesi’nin ilgili hükümleri uyarnca tarafmzdan de÷erlendirilerek savunmaya de÷er bulunmuú ve ………… tarihinde yaplan tez savunma snavnda aday oybirli÷i/oyçoklu÷u ile baúarl bulunmuútur. Jüri Üyeleri: imza Jüri BaúkanÕ :………………………………… ………… Raportör Üye :………………………………… ………… Üye ………… :………………………………… IV V ÖZET øNVERTAZ ENZøMøNøN AFøNøTEYE DAYALI TEKNøKLER øLE SAFLAùTIRILMASI Yücekan, øLKE Yüksek Lisans Tezi, Biyokimya Anabilim Dal Tez Yöneticisi: Doç. Dr. Seçil ÖNAL Temmuz 2008, 186 sayfa ønvertazlar (ȕ-fruktofuranozidaz, E.C 3.2.1.26), (Sükraz), endüstriyel alanda özellikle gda sanayinde pek çok uygulama alanna sahip enzimlerdir. Proteinler ve enzimlerin saflaútrlmasnda kullanlan pek çok biyokimyasal izolasyon ve saflaútrma metodu mevcut olmasna ra÷men son yllarda afiniteye dayal yeni tekniklerin (afinite çöktürmesi, afinite membranlar, sulu ikili ve üçlü faz sistemleri gibi) özellikle enzimlerin saflaútrlmasnda kullanlmaya baúlanmas oldukça dikkat çekicidir. Bu çalúmada, invertaz enzimi domatesten (Lycopersicon esculentum) ekstrakte edilerek PEG/Tuz sulu ikili faz sistemi (ATPS) ile ilk kez tarafmzdan saflaútrlmú ve karakterize edilmiútir. Bu çalúmada sulu ikili faz sisteminin optimizasyonu ve enzim aktivitesine etki eden VI baz parametrelerin etkisi incelenerek kararllk testleri (termal, pH, depo) yaplmútr. Enzim aktivitesi dinitrosalisilik asit (DNS) metodu ile, protein tayini ise Bradford metodu ile gerçekleútirilmiútir. % 15 PEG–3000, % 12 Na2SO4 ve % 5 KCl (pH 4.5, 25oC) kullanlarak hazrlanan sulu ikili-faz sisteminde invertaz enzimi PEG’ce zengin üst fazda toplanmútr ve yaklaúk 6.7 kat saflaútrma elde edilmiútir. Ayrca, son admda uygulanan ultrafiltrasyon iúlemi ile enzim homojenata kyasla 31 kat saflaútrlmútr. Enzimin molekül kütlesi SDSPAGE ile yaklaúk 20 kDa olarak, optimum pH ve scakl÷ ise srasyla 5.0 ve 50oC olarak belirlenmiútir. Enzimin Km ve Vmax de÷erleri srasyla 48 mM ve 31 U olarak belirlenmiútir. Polimer-Tuz tabanl ATPS ile saflaútrlan domates invertaz geniú bir pH ve scaklk aral÷nda oldukça kararl bir enzim preparatdr. Geleneksel metodlara kyasla, invertazn saflaútrlmasnda kullanlan bu tek adml ekstraksiyon metodu basit, ekonomik ve etkili bir metod olup hazrlanan enzim preparat sahip oldu÷u katalitik özellikleri bakmndan gda sanayinde kullanlabilecek uygun bir enzim preparatdr. Anahtar kelimeler: ønvertaz, Lycopersicon esculentum, Sulu økili Faz Sistemi (ATPS), Saflaútrma, Karakterizasyon VII ABSTRACT PURIFICATION OF INVERTASE ENZYME BY AFFINITY TECHNIQUES YUCEKAN, Ilke Master of Science Thesis, Biochemistry Department Supervisor: Ass. Prof. Dr. Seçil Önal July, 2008, 186 pages Invertases (ȕ-fructofuranosidase, E.C 3.2.1.26), (Sucrase), have many applications in industrial area especially in food industry. In spite of many biochemical isolation and purification methods for purification of proteins and enzymes, new affinity techniques (affinity precipitation, affinity membrane, aqueous two phase and aqueous three phase systems) were begun to use in enzyme purification at last years. The tomato (Lycopersicon esculentum) invertase was purified by using an aqueous two-phase system (ATPS) composed of PEG / Salt for the first time and characterized. In this study, the partitioning behavior of tomato invertase in PEG / Salt aqueous two-phase systems was optimized and several parameters that effect enzymatic activity were investigated. Invertase activity and protein determination was performed by Dinitrosalicylic (DNS) method and Bradford method, respectively. VIII In % 15 PEG–3000, % 12 Na2SO4 ve % 5 KCl (pH 4.5, 25oC) aqueous two-phase system invertase partitioned to the PEG-rich top phase and about 6.7 fold purification was achieved. Ultrafilration was carried out at the last step and 31 fold purification was achieved. The enzyme has apparent molecular mass of 20 kDa by SDS-PAGE and its optimum pH and temperature for sucrose hydrolysis were determined to be 5.0 and 50oC, respectively. The Km ve Vmax values for sucrose were 48 mM and 31 U, respectively. Polymer-Salt based ATPS purified tomato invertase showed very stable characteristic for large pH and temperature range. Compared to multi-step conventional down stream processing, ATPS is a single-step extraction process who has been recognized as a simple, economical and effective method. According to the catalytic properties this enzyme preparation can be used for industrial applications. Keywords: Invertase, Lycopersicon esculentum, Aqueous Two Phase Systems (ATPS), Purification, Characterization IX TEùEKKÜRLER Yüksek lisans çalúmamn her aúamasnda kymetli görüúlerinden, deste÷inden ve yardmndan yararland÷m, en baúta danúmanm sayn Doç. Dr. Seçil Önal’a, Biyokimya bölümü ö÷retim elemanlarna ve son olarak, tüm destekleri ve cesaretlendirmeleri için aileme ve arkadaúlarma teúekkürü bir borç bilirim. Bu çalúma desteklenmiútir. Ege Üniversitesi Araútrma Fonu tarafndan X XI øÇøNDEKøLER Sayfa ÖZET ................................................................................................. V ABSTRACT ...................................................................................... VIII TEùEKKÜR....................................................................................... IX øÇøNDEKøLER ................................................................................. XI ùEKøLLER DøZøNø .......................................................................... XV ÇøZELGELER DøZøNø .................................................................... XIX 1. 1.1 GøRøù ........................................................................................ 1 Glikozidazlar ............................................................................. 2 1.1.1 1.1.2 1.1.3 1.1.4 1.1.5 1.1.6 2. 2.1 2.1.1 2.1.2 2.2 2.3 2.4 2.4.1 2.4.2 ønvertazlar ve invertazlarn biyokimyas................................... 5 ønvertazlarn etki mekanizmas ............................................... 14 ønvertazlarn izolasyonu ve saflaútrlmas.............................. 20 ønvertazlarn fiziksel özellikleri .............................................. 23 ønvertazlarn kinetik özellikleri ............................................... 26 ønvertazlarn fizyolojik önemi ve uygulama alanlar .............. 44 SULU øKøLø FAZ SøSTEMø (ATPS) ..................................... 50 Faz Diyagramlar..................................................................... 52 Binodiyal e÷ri.......................................................................... 54 Tie-line hatlar......................................................................... 56 Da÷lma Katsays (K)............................................................. 57 Da÷lma Mekanizmas ............................................................ 59 Protein Da÷lmn Etkileyen Parametreler ............................. 60 Polimer konsantrasyonu ve molekül kütlesinin etkisi............. 62 Tuz türü ve konsantrasyonunun etkisi..................................... 64 XII øÇøNDEKøLER (devam) 2.4.3 pH etkisi ……………………………………………………..65 2.4.4 2.4.5 2.4.6 2.4.7 2.4.8 2.5 Scakl÷n etkisi .......................................................................66 Hidrofobik etkileúimler............................................................67 Protein konsantrasyonunun etkisi ............................................67 Zamann etkisi .........................................................................67 Düúük molekül kütleli maddelerin etkisi .................................68 Sulu økili Faz Sisteminin Uygulamala Alanlar.......................68 3. 3.1 3.2 3.3 3.4 3.4.1 3.4.2 3.4.3 3.5 3.5.1 3.5.2 3.6 3.6.1 3.6.2 MATERYAL VE METOD......................................................76 Materyal .................................................................................76 ønvertaz Aktivitesi Tayini ........................................................77 Protein Tayini (Bradford Metodu)...........................................80 Sodyum Dodesil Sülfat Poliakrilamid Jel Elektroforezi (SDSPAGE) ve Moleküler Kütle Tayini..........................................81 Polimerizasyon protokolü ........................................................82 Örneklerin hazrlanmas ve elektroforez uygulanmas ............84 Protein bantlarnn boyanmas .................................................85 Sulu økili Faz Sistemi (ATPS) øle ønvertazn Domatesten (Lycopersicon esculentum) øzolasyonu ve Saflaútrlmas.......85 Sulu ikili faz sisteminin hazrlanmas......................................86 Da÷lma parametrelerinin belirlenmesi ...................................87 Domates (Lycopersicon esculentum) ønvertaznn Karakterizasyonu .....................................................................90 ønvertaz aktivitesine baz parametrelerin etkisi .........................90 Kararllk testleri ........................................................................92 XIII øÇøNDEKøLER (devam) 4. 4.1 ve 4.2 4.2.1 4.2.2 4.2.3 4.2.4 4.2.5 4.2.6 4.2.7 4.2.8 SONUÇLAR VE TARTIùMA ................................................. 94 ønvertazn Domatesten (Lycopersicon esculentum) øzolasyonu . Ksmi Saflaútrlmas ............................................................... 94 Sulu økili Faz Sistemi (ATPS) øle Domates (Lycopersicon esculentum) ønvertaznn Saflaútrlmas ................................. 99 Tuz türünün belirlenmesi ……………………………….....100 PEG molekül kütlesinin belirlenmesi… ……………………103 PEG (3000) konsantrasyonun belirlenmesi…………………..106 Na2SO4 konsantrasyonunun belirlenmesi…………………...108 pH etkisinin belirlenmesi…………………………………….111 Kosolut tuz türü ve konsantrasyonun etkisinin belirlenmesi (øyonik úiddetin etkisinin belirlenmesi) ………………….114 ønvertaz konsantrasyonun da÷lma etkisi ………………….120 Büyük ölçekli sulu ikili faz sistemi ………………………….122 Domates (Lycopersicon esculentum) ønvertaznn Karakterizasyonu................................................................... 125 4.3.1 ønvertaz aktivitesine pH etkisi............................................... 125 4.3.2 ønvertaz aktivitesine scakl÷n etkisi .................................... 126 4.3.3 ønvertaz aktivitesine substrat konsantrasyonunun etkisi ....... 128 4.3.4 ønkübasyon süresinin etkisi ................................................... 130 4.3.5 Efektör konsantrasyonunun etkisi ......................................... 131 4.4 Kararllk Testleri .................................................................. 132 4.4.1 ønvertazn termal kararll÷................................................... 132 4.4.2 ønvertazn pH kararll÷........................................................ 133 4.4.3 ønvertazn depo kararll÷ ..................................................... 135 4.5 Genel De÷erlendirme ............................................................ 136 KAYNAKLAR DøZøNø.......................................................................156 4.3 ÖZGEÇMøù…………………………………………………………..185 XIV ùEKøLLER DøZøNø ùekil Sayfa 1.1 Genel reaksiyon mekanizmas ........................................................6 1.2 ønvertaz enziminin üç-boyutlu yaps .............................................10 1.3 Hücre duvar ve vakular invertazlarn aminoasit motifi .................12 1.4 Hücre duvar ve vakular invertazlarn filogenetik gösterimi ..........12 1.5 Glikozidazlarn retensiyon mekanizmas........................................15 1.6 Glikozidazlarn inversiyon mekanizmas........................................16 1.7 ønvertazn sükroz kataliz mekanizmas...........................................17 1.8 Arabidopsis thaliana invertaznn kristal yaps .............................19 1.9 Thermotoga maritima invertaznn kristal yaps ...........................20 1.10 ønvertazn do÷al substratlar.........................................................26 1.11 ønvertazlarn do÷al substratlar .....................................................30 1.12 Fruktozun yapsal analoglar.........................................................40 1.13 Schwanniomyces occidentalis invertaznn transfruktozilleme reaksiyonu .....................................................47 1.14 Arthrobacter globiformis invertaznn transfruktozilleme reaksiyonu.....................................................................................48 2.1 Faz diyagram .................................................................................53 2.2 Turbidometrik titrasyon ve “cloud-point” metotlar.......................55 2.3 Tie-line hatlar ................................................................................56 2.4 PEG / Tuz sistemlerinde biyomoleküllerin da÷lmas ....................62 2.5 Sulu ikili faz sistemi ile DNA izolasyonu ......................................71 2.6 Sulu ikili faz sistemiyle membran proteinin izolasyonu.................72 XV ùEKøLLER DøZøNø (Devam) 2.7 Sürekli karútrmal kontaktör ........................................................ 74 3.1 DNS yönteminin prensibi............................................................... 77 3.2 Sükrozun invertaz tarafndan hidroliz reaksiyonu ......................... 78 3.3 Glukozun enol anyonuna dönüúüm reaksiyonu ............................. 79 4.1 Domates invertaznn SDS-Poliakrilamid jel elektroforezi............ 97 4.2 % 12,5 PEG / % 12,5 Na2SO4 sisteminde PEG molekül kütlesinin protein da÷lma katsaysna (Kp) etkisi ....................... 105 4.3 % 12,5 PEG / % 12,5 Na2SO4 sisteminde PEG molekül kütlesinin invertaz enziminin da÷lma katsaysna (Ke) etkisi ... 106 4.4 PEG-3000 konsantrasyonunun PEG/Na2SO4 sisteminde invertaz ekstraksiyonuna ve da÷lmna etkisi ............................. 107 4.5 PEG-3000 konsantrasyonunun PEG-Na2SO4 sisteminde invertaz da÷lma katsaysna (Ke) etkisi ...................................... 108 4.6 Na2SO4 konsantrasyonunun PEG/Na2SO4 sisteminde invertaz ekstraksiyonuna ve da÷lmna etkisi ........................................... 109 4.7 % 15 PEG-Na2SO4 sisteminde Na2SO4 konsantrasyonunun protein da÷lma katsaysna (Kp) etkisi ...................................... 110 4.8 % 15 PEG-% 12 Na2SO4 sisteminde invertaz ekstraksiyonuna ve da÷lmna pH’n etkisi............................................................ 112 4.9 % 15 PEG-% 12 Na2SO4 sisteminde pH’n invertaz da÷lma katsaysna (Ke) etkisi .................................................................. 113 4.10 % 15 PEG-% 12 Na2SO4 sisteminde pH’n protein da÷lma katsaysna (Kp) etkisi.................................................................. 113 4.11 Kosolut olarak KCl’ün PEG-Na2SO4 sistemine etkisi ................. 116 XVI ùEKøLLER DøZøNø (Devam) 4.12 Kosolut olarak KCl’ün farkl konsantrasyonlarnn protein da÷lma katsaysna (Kp) ve invertazn da÷lma katsaysna (Ke) etkisi..............................................................................................116 4.13 Kosolut olarak KCl’ün farkl konsantrasyonlarnn selektivite (Į) ve geri kazanma (R) etkisi ....................................................117 4.14 Kosolut olarak NaCl’ün PEG-Na2SO4 sistemine etkisi................117 4.15 Kosolut olarak Na2CO3’n PEG-Na2SO4 sistemine etkisi ............118 4.16 Kosolut olarak MgSO4’n PEG-Na2SO4’nsistemine etkisi..........118 4.17 Kosolut olarak MnCl2’ün PEG-Na2SO4 sistemine etkisi..............119 4.18 Kosolut olarak MgCl2’ün PEG-Na2SO4 sistemine etkisi..............119 4.19 % 15 PEG-3000 / % 12 Na2SO4 / pH 4.5 / % 5 KCl sisteminde invertazn da÷lmna (Ke) ve selektivitesine (Į) enzim miktarnn etkisi .................................................................121 4.20 % 15 PEG-3000 / % 12 Na2SO4 / pH 4.5 / % 5 KCl sisteminde invertaz saflaútrma katsays ve protein da÷lma katsaysna enzim miktarnn etkisi ..............................................122 4.21 Büyük ölçekli PEG 3000- Na2SO4 sisteminde invertaz enziminin saflaútrma sonuçlar ....................................................123 4.22 Büyük ölçekli PEG 3000- Na2SO4 sisteminde invertaz enziminin saflaútrma sonuçlar .....................................................................124 4.23 10, 25 ve 50 ml’lik sistemlerde saflaútrlan invertaz enziminin spesifik aktivite de÷erleri..............................................................124 4.24 ønvertaz aktivitesine pH’n etkisi..................................................126 4.25 ønvertaz aktivitesine scakl÷n etkisi) ..........................................127 XVII ùEKøLLER DøZøNø (Devam) 4.26 Sükroz konsantrasyonunun invertaz aktivitesine etkisi ............... 129 4.27 ønvertaz enziminin Lineweaver-Burk diyagramlar ..................... 129 4.28 ønkübasyon süresinin invertazn aç÷a çkard÷ glukoz miktar ile iliúkisi ........................................................................................... 130 4.29 ønvertazn termal kararll÷.......................................................... 133 4.30 ønvertazn pH kararll÷ ............................................................... 134 4.31 Domates invertaznn depo kararll÷ .......................................... 135 XVIII ÇøZELGELER DøZøNø Çizelge Sayfa 1.1 Oligosakkarit yaplarnn aydnlatlmasnda kullanlan baz ekzoglikozidazlar (Jacob and Scudder, 1994). ..............................5 1.2 Baz invertazlarn molekül kütleleri. ..............................................25 1.3 ønvertazlarn substrat spesifiklikleri. ..............................................28 1.4 Baz invertazlarn termal kararllklar............................................35 1.5 Baz invertazlarn optimum pH de÷erleri .......................................38 1.6 Çeúitli inhibitörlerin invertaz aktivitesine etkisi.............................42 4.1 ønvertaz enziminin da÷lmna faz bileúimi ve tuz türünün etkisi...102 4.2 ønvertaz enziminin da÷lmna PEG molekül kütlesinin etkisi. ......103 4.3 Çeúitli efektörlerin invertaz aktivitesine etkisi. ..............................131 1 1. GøRøù ønvertazlar (ȕ-fruktofuranozidaz, E.C 3.2.1.26), (Sükraz), ȕ-Dfruktofuranozidlerin terminal indirgen olmayan ȕ-fruktofuranozid artÕklarÕnÕn hidrolizini katalizleyen hidrolaz sÕnÕfÕ enzimlerdir. Do÷ada oldukça yaygÕn olarak bulunan bu enzim pek çok bitkisel ve mikrobiyal kaynaktan izole edilerek saflaútÕrÕlmÕútÕr. ønvertaz enzimi, kimli÷i ilk belirlenen proteinler arasÕnda bulunmaktadÕr ve enzim kineti÷inin prensiplerinin çÕkarÕlmasÕnda kullanÕlmÕútÕr (Michaelis and Menten, 1913). ønvertazlar, endüstriyel alanda özellikle gÕda sanayinde pek çok uygulama alanÕ bulmuú enzimler olup bu alanlara örnek olarak; úekerleme sanayindeki uygulamalar, kamÕú melasÕnÕn etanole fermantasyonu, sÕ÷Õr yemlerinin hazÕrlanmasÕ, invert úeker úuruplarÕnÕn hazÕrlanmasÕ verilebilir. GÕda sanayinde invert úeker úuruplarÕnÕn hazÕrlanmasÕnda ya asit hidrolizi yada enzimatik olarak sukrozun invertaz ile hidrolizi gerçekleútirilmektedir. Asit hidrolizi oldukça yüksek úiddette renkli ürünler, kül ve istenmeyen pek çok yan ürün oluúturdu÷u için endüstriyel alanda enzimatik hidroliz tercih edilmektedir. Hidroliz sonucu oluúan fruktoz, kolay kolay kristalize olmadÕ÷Õ ve daha tatlÕ oldu÷u için gÕda sanayinde sukroza tercih edilmektedir. Bu tür uygulamalarda hem sa÷lÕk hem de tat açÕsÕndan gÕda sanayinde kullanÕlacak olan invertazÕn tolere edilebilir bir saflÕkta olmasÕ ve ekonomik olmasÕ istenir. Proteinler ve enzimlerin saflaútÕrÕlmasÕnda kullanÕlan pek çok biyokimyasal izolasyon ve saflaútÕrma metodu mevcut olmasÕna ra÷men 2 son yÕllarda afiniteye dayalÕ yeni tekniklerin (afinite çöktürmesi, afinite membranlarÕ, sulu ikili ve üçlü faz sistemleri gibi) özellikle enzimlerin saflaútÕrÕlmasÕnda kullanÕlmaya baúlanmasÕ oldukça dikkat çekicidir. Bu çalÕúmada, domatesten izole edilen invertaz enzimi ikili sulu faz sistemi (ATPS) kullanÕlarak ilk kez tarafÕmÕzdan saflaútÕrÕlmÕútÕr. ønvertaz kayna÷Õ olarak seçilen domates, ülkemizde kolay temin edilebilmesi, ekonomik bir kaynak olmasÕ, ayrÕca invertaz miktarÕ ve aktivitesi açÕsÕndan zengin olmasÕ nedeniyle uygun bir enzim kayna÷ÕdÕr. økili sulu faz sistemi (ATPS) olarak polimer-tuz (Polietilen glikol; PEG-Tuz) sistemi seçilmiútir. ATPS ile invertaz enziminin saflaútÕrma koúullarÕ optimize edilmiú ve bu amaçla uygun tuz türü, tuz konsantrasyonu, PEG molekül kütlesi, PEG konsantrasyonu, pH gibi parametrelerin etkisi incelenmiútir. 1.1 Glikozidazlar ønvertazlar, glikozidazlarÕn bir alt sÕnÕfÕ olan hidrolitik enzimlerdir. Glikozidazlar da glikozil bileúikleri üzerinde etkili olan oldukça geniú ve önemli bir enzim grubudur. Basit glikozidler ile kompleks oligo- ve polisakkaritlerdeki glikozidik ba÷larÕn hidrolizini katalizlerler. Glikopiranozil gruplarÕ ile glikozidik ba÷larÕn anomerik konfigürasyonlarÕna karúÕ oldukça spesifik olan glikozidazlar, hayvanlarda, bitkilerde ve mikroorganizmalarda oldukça yaygÕn olarak bulunurlar. YaklaúÕk olarak 150 yÕldan bu yana araútÕrmacÕlar glikozidazlarla ilgili farklÕ çalÕúmalar yapmÕúlardÕr. Uzun zamandan beri biyokimyanÕn en ilginç araútÕrma konularÕndan birisi olmasÕna ra÷men glikozidazlarÕn moleküler özellikleri ve etki mekanizmalarÕ hakkÕnda çok az bilgi edinilebilmiú ve sadece birkaç tanesi kristalize edilebilmiútir. 3 Amilaz ve lizozim kristal formda elde edilen glikozidaz sÕnÕfÕ enzimlerdendir. GlikozidazlarÕn bir kÕsmÕ glikozil artÕklarÕnÕ oligosakkaritlere, polisakkaritlere ve di÷er alkolik reseptörlere transfer ettikleri halde hidrolaz sÕnÕfÕna dahil edilirler. Glikozidazlar, O-glikozil, N-glikozil ve S-glikozil bileúiklerini hidrolizleyen enzimler (EC 3.2.1, 3.2.2, 3.2.3) olarak üç gruba ayrÕlÕrlar ve çok çeúitli glikozidik ba÷lar üzerinde etkilidirler. Örne÷in; Į-amilaz (EC 3.2.1.1), ȕ-amilaz (EC 3.2.1.1), ekzo1,4-Į-D-glukozidaz (EC 3.2.1.3), sikloheptaglukanaz (EC 3.2.1.12) ve siklohegzaglukanaz (EC 3.2.1.13) Į-1,4-glikozidik ba÷larÕ, amilopektin1,6-glukozidaz (EC 3.2.1.9), oligo-1,6-glukozidaz (EC 3.2.1.10) ve dekstranaz (EC 3.2.1.11) Į-1,6-glikozidik ba÷larÕ, Į-galaktozidaz ise Į1,6-glikozidik ba÷larÕ hidrolizler. Temel olarak yüklü grup içermeyen substratlarla ilgilidirler. Tüm belirleyici gruplar ya hidroksil gruplarÕ yada hidrojen atomlarÕdÕr. Bu nedenle de spesifikleri bir model ile belirlenmelidir. Genel olarak belirli bir monosakkarit halkasÕna spesifiktirler, fakat ba÷lÕ aglikon grubu yüksek ya da düúük bir etkiye sahiptir ve bazen de enzim bir aglikona spesifik olabilir. Glikozidazlar özellikle úeker halkasÕnÕn konfigürasyonuna spesifiktirler. Örne÷in; Įgalaktozidazlar monosakkarit, oligosakkarit, glikopeptid ve fenole Įba÷lÕ terminal galaktoz artÕklarÕnÕ, ȕ-galaktozidazlar ise ȕ-1,6-, ȕ-1,4veya ȕ-1,3- ba÷lÕ terminal galaktoz artÕklarÕnÕ hidrolizleyebilirler. Glikozidazlar, genel olarak endo- ve ekzo- glikozidazlar olarak iki gruba ayrÕlÕrlar. Glikoproteinler üzerinde etkili olan endoglikozidazlar; endo- ȕ-galaktozidaz (EC 3.2.1.103), endoglikozidaz D (EC 3.2.1.96), endoglikozidaz F (EC 3.2.1.96), endoglikozidaz H (EC 3.2.1.96) ve glikopeptidaz F (EC 3.2.1.18) dir. Polisakkaritler üzerinde etkili olan endoglikozidazlar; Į-amilaz (EC 3.2.1.1), selülaz (EC 3.2.1.4), 4 hyalurinidaz (EC 3.2.1.45), lizozim (EC 3.2.1.17) ve pullulanaz (EC 3.2.1.41) dÕr. Ekzoglikozidazlar ise sadece terminal artÕklar üzerinde etkilidirler. Bunlar; ȕ-N-asetil-D-glukozaminidaz (EC 3.2.1.30), ȕ-amilaz (EC 3.2.1.2), amiloglukozidaz (EC 3.2.1.3), ȕ-fruktofuranozidaz (EC 3.2.1.26), Į-L-fukozidaz (EC 3.2.1.51), Į-galaktozidaz (EC 3.2.1.22), ȕgalaktozidaz (EC 3.2.1.23), Į-glukozidaz (EC 3.2.1.20), ȕ-glukozidaz (EC 3.2.1.21), ȕ-glukuronidaz (EC 3.2.1.31) ve nörominidaz (EC 3.2.1.18) dÕr (Önal Tatar, 1994; Agrawell and Bahl, 1968). Glikozidazlar yapÕsal karakterizasyonlarda da kullanÕlan en önemli enzim grubudur. Nükleer manyetik rezonans(NMR), hÕzlÕ atom bombardmanÕ, elektrospray-kütle spektrometrisi gibi analitik metodlarÕn geliúmesiyle beraber yapÕ tayinlerinde enzimlerin kullanÕmÕ büyük olasÕlÕkla azalacaktÕr. Fakat bu tekniklerin elde edilemedi÷i durumlarda enzimler hala oldukça güçlü ve etkili bir araç olmaya devam edecektir. Oligosakkaritlerin yapÕlarÕnÕn aydÕnlatÕlmasÕnda kullanÕlan bazÕ ekzoglikozidazlar Çizelge 1.1’de verilmiútir (Jacob and Scudder, 1994). 5 Çizelge 1.1 Oligosakkarit yapÕlarÕnÕn aydÕnlatÕlmasÕnda kullanÕlan bazÕ ekzoglikozidazlar (Jacob and Scudder, 1994). Enzim Į-Mannozidaz-I Hegsozaminidaz ȕ-Galaktozidaz Į-Fukozidaz Į-Galaktozidaz Į-Nörominidaz Kaynak A.saitoi Baklagil tohumu Baklagil tohumu C.lampas Kahve tohumu A.ureafaciens Domuz Į-Glukozidaz-I karaci÷eri Domuz Į-Glukozidaz-II karaci÷eri 1.1.1 Hidrolizlenen Ba÷ ManĮ1–2 Man GalNAc/GlcNAcȕ1–2,3,4,6 Galȕ1–3,4,6 FucĮ1-2GalGalȕ –3(FucĮ 1– 4)GlcNAc GalĮ1–3,4,6 NeuAc/NeuGcĮ2–3/6Gal GlcĮ1-2Glc GlcĮ1-3Gl ve GlcĮ1-3Man ønvertazlar ve invertazlarÕn biyokimyasÕ ønvertazlar (ȕ-fruktofuranozidaz, E.C 3.2.1.26), (Sükraz), do÷ada oldukça yaygÕn olarak bulunan hidrolaz sÕnÕfÕ enzimlerdir. Çok sayÕda Į1-ȕ2-glikozidik ba÷Õn hidrolizini katalizlerler (Guimarães et al., 2007; Warchol et al., 2002; Janer et al., 2004; Nakamura et al., 1988; ÁlvaroBenito et al., 2007) : 1. Disakkaritler; sükroz, 2. Trisakkaritler; rafinoz, melibioz, 3. Oligosakkaritler; rafinoz, stakiyöz, nistoz, 4. Polisakkaritler; levan, inulin. ùekil 1.1’de invertaz enziminin genel hidroliz reaksiyonu verilmiútir. 6 ùekil 1.1 Genel reaksiyon mekanizmasÕ ønvertazlar çok çeúitli kaynaklardan; mikroorganizmalar (Chavez et al., 1997; L’Hocine et al., 2000; Nguyen et al., 2004; Belcarz et al., 2001; Tanaka et al., 1998; Rubio et al., 2002; Tanaka et al., 1998) ve bitkilerden (Vorster and Botha, 1998; Hashizume et al., 2003; Isla et al., 1998; Bosch et al., 2003; Zhang and Chi, 2003; Leigh et al., 1979; Dreier et al., 1998; Morell and Copeland, 2006; Lingle and Dunlap, 1987; Liu et al., 2005; Rojo et al., 1998; Hsiao et al., 2001) farklÕ biyokimyasal teknikler kullanÕlarak izole edilip saflaútÕrÕlmÕútÕr. Bu saflaútÕrma çalÕúmalarÕnÕn yanÕnda invertazlarla yapÕlan immobilizasyon çalÕúmalarÕ oldukça fazla sayÕdadÕr. Mikrobiyal kaynaklÕ invertazlarla yapÕlan immobilizasyon çalÕúmalarÕ ise daha çok endüstriyel olarak kullanÕm alanÕ bulmuútur (Tomotani and Vitolo, 2006; Bayramo÷lu et al., 2002; Sanjay and Sugunan, 2004; Bagal and Karve, 2005; Gürsel et al., 2003). ønvertazlar çok geniú uygulama alanÕ olan enzimlerdir. Enzim saflaútÕrÕlmasÕnda kullanÕlan metodlarda dikkate de÷er ölçüde bir geliúme olmasÕna ra÷men kontamine glikozidazlarÕn ortamdan uzaklaútÕrÕlmasÕ hala oldukça güç bir iúlemdir. E÷er hazÕrlanan invertaz preparatÕ di÷er glikozidazlar tarafÕndan kontamine edilmiyorsa ve geniú bir aglikon spesifikli÷ine sahipse, yapÕsal analizlerde ve kompleks karbohidratlarÕn biyolojik fonksiyonlarÕnÕn belirlenmesinde (Frevert and Ballou, 1982; 7 Gómez and Villalonga, 2000; Kern et al., 1992; Zeng and Biemann, 1999), enzimatik sentezlerde (Rodriguez et al., 1996; Masayoshi and Teruo, 1995), transglikozilasyon reaksiyonlarÕnda (Fernández et al., 2004; Álvaro-Benito et al., 2007; Win et al., 2004) ve hayvanlar ile insanlarda intestinal sistemde konstipasyon sorununun giderilmesini sa÷layan oligosakkaritlerin sentezinde (Nguyen et al., 2005; Hidaka et al., 1986) kullanÕlabilecek uygun bir preparattÕr. ønvertazlar, endüstriyel alanda özellikle gÕda sanayinde pek çok uygulama alanÕ bulmuú enzimler olup bu alanlara örnek olarak; úekerleme sanayindeki uygulamalar, kamÕú melasÕnÕn etanole fermantasyonu, sÕ÷Õr yemlerinin hazÕrlanmasÕ, invert úeker úuruplarÕnÕn hazÕrlanmasÕ verilebilir. Hidroliz sonucu oluúan fruktoz, kolay kolay kristalize olmadÕ÷Õ ve daha tatlÕ oldu÷u için gÕda sanayinde sukroza tercih edilmektedir. Bu tür uygulamalarda hem sa÷lÕk hem de tat açÕsÕndan gÕda sanayinde kullanÕlacak olan invertazÕn tolere edilebilir bir saflÕkta olmasÕ ve ekonomik olmasÕ istenir. FarklÕ kaynaklardan saflaútÕrÕlan invertazlarÕn bir kÕsmÕnÕn glikoprotein karakterinde oldu÷u tespit edilmiútir. Saccharomyces cerevisiae (Bahar ve Tuncel, 2004), Rhodotorula glutinis (Rubio et al., 2002), Aspergillus niger AS0023 (Hocine et al., 2000), Lactobacillus reuteri CRL 1100 (Ginés et al., 1999), Candida utilis (Chávez et al., 1997) Schizosaccharomyces pombe (Tanaka et al., 1998), mango (Rahman et al., 2001), patates (Isla et al., 1998) ve tütün (Rojo et al., 1998) invertazlarÕnÕn birer glikoprotein olduklarÕ belirtilmiútir. Aspergillus nidulans invertazÕnÕn yüksek molekül a÷ÕrlÕklÕ Sinvertaz ve düúük molekül a÷ÕrlÕklÕ F-invertaz formlarÕnÕn glikoprotein yapÕda oldu÷u ve her iki formun karbohidrat içeri÷inin sÕrasÕyla % 21.1 8 ve % 44.4 oldu÷u belirlenmiútir. S-ønvertaz’Õn karbohidrat kÕsmÕnÕn % 5 galaktoz, % 14.3 mannoz, % 0.9 N-asetilglukozamin ve % 1.9 glukozdan ibaret oldu÷u fakat F-ønvertaz’Õn karbohidrat kÕsmÕnÕn % 29.5 galaktoz, % 11.9 mannoz, % 0.3 N-asetilglukozamin ve % 2.7 glukoz içerdi÷i belirtilmiútir (Chen et al., 1996). Aspergillus niger IMI303386 invertazÕ 120–130 kDa molekül kütleli homodimerik bir protein olup, molekül a÷ÕrlÕ÷ÕnÕn % 17’si karbohidrattan oluúmuú bir glikoproteindir (Nguyen et al., 2004). Son yÕllarda invertazlarla yapÕlan klonlama çalÕúmalarÕ da oldukça büyük bir önem ve hÕz kazanmÕútÕr. SaflaútÕrÕlan enzimin oldukça büyük miktarda üretilmesi ve enzimatik özelliklerinin geliútirilmesi için invertazÕn cDNA klonunun izole edilerek dizisinin aydÕnlatÕlmasÕ gerekmektedir. Bu amaçla yapÕlan çalÕúmalardan birisinde Japon armudu asit invertazÕnÕn iki izoenzimini kodlayan cDNA’lar (PsS-AIV1 ve PsSAIV2) önce klonlanmÕú ve ardÕndan dizisi aydÕnlatÕlmÕútÕr. PsS-AIV1 646 aminoasitlik bir proteini, PsS-AIV2 ise 682 aminoasitlik bir proteini kodlamaktadÕr. PsS-AIV1 ve PsS-AIV2 arasÕnda aminoasit dizilimi bakÕmÕndan % 40 ve nükleotid dizilimi bakÕmÕndan ise % 46’lÕk bir dizi benzerli÷i vardÕr. PsS-AIV1 cDNA’sÕ, Prunus ceranus ve “La France” armudu cDNA’larÕ ile sÕrasÕyla % 72 ve % 98 benzerlik göstermektedir. PsS-AIV2 cDNA’sÕ ise, Citrus unshiu ve “La France” armudu cDNA’larÕ ile sÕrasÕyla % 60 ve % 98 benzerlik göstermektedir (Yamada et al., 2006). ønvertaz cDNA’sÕ çok çeúitli kaynaklardan; Zymomonas mobilis, Thermotoga maritima, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe gibi mikroorganizmalar yanÕnda Chenopodium rubrum, Ipomoea batatas, Arabidopsis thaliana, Daucus carota, Lycopersicon esculentum, Carica papaya gibi bitkilerin kök, yaprak, tohum gibi kÕsÕmlarÕndan klonlanmÕútÕr (Roitsch and González, 2004 ve Yamada et al., 2006). 9 GlikozidazlarÕn sÕnÕflandÕrÕlmasÕ, aminoasit dizi benzerliklerine dayanarak familyalar halinde yapÕlmaktadÕr. Bugüne kadar 112 tanesi familya halinde sÕnÕflandÕrÕlmÕútÕr. BazÕ glikozidaz familyalarÕ evrimsel, yapÕsal ve mekanistik olarak iliúkili olduklarÕndan yüksek hiyerarúik düzeydeki, “klan” olarak tasvir edilen gruplarda gruplandÕrÕlmÕútÕr. ønvertazlar, göstermiú olduklarÕ yüksek dizi homoloji derecesi ve amino asit sÕrasÕna göre glikozidazlarÕn GH 32, GH 68 ve GH 100 familyalarÕnda yer almaktadÕr. GH 32 familyasÕ; invertaz (EC 3.2.1.26); inulinaz (EC 3.2.1.7); 2,6-ȕ-fruktan 6-levanbiyohidrolaz (EC 3.2.1.64); levanaz (EC 3.2.1.65); ekzo-inulinaz (EC 3.2.1.80); sukroz: sukroz 1fruktoziltransferaz (EC 2.4.1.99); fruktan: fruktan 1-fruktoziltransferaz (EC 2.4.1.100); fruktan ȕ-(2,1)-fruktozidaz (EC 3.2.1.153); fruktan ȕ(2,6)-fruktozidaz (EC 3.2.1.154); sukroz: fruktan 6-fruktoziltransferaz (EC 2.4.1.-), GH 68 familyasÕ; levansukraz (EC 2.4.1.10); ȕfruktofuranozidaz (EC 3.2.1.26); inulosukraz (EC 2.4.1.9) ve GH 100 familyasÕ ise; alkali ve nötral invertazdan (EC 3.2.1.26) oluúmaktadÕr. GH 32 ve GH 68 familyalarÕ klan GH-J’de yer almaktadÕr. Bugüne kadar GH 32 familyasÕ bitki, fungus ve bakteri orijinli yaklaúÕk olarak 743 tane üye içermektedir (http://www.cazy.org/). GH 32 familyasÕnda yer alan Thermotoga maritima invertazÕ, Arabidopsis thaliana invertazÕ, Aspergillus awamori ekzo-inulinazÕ ve Cichorium intybus 1-ekzohidrolazÕnÕn kristal yapÕlarÕ aydÕnlatÕlmÕútÕr. Üç boyutlu yapÕlarÕ hakkÕnda yapÕlan çalÕúmalar sonucunda benzer bimodüler düzenleme; N-terminal beú katlÕ ȕ-propeller (pervane) katalitik modül ile ba÷lantÕlÕ C-terminal ȕ-sandviç modül, göstermektedirler (ùekil 1.2) (Lammens et al., 2008). Beú katlÕ ȕ-propeller (pervane) modülde merkezde katalitik aktif bölge bulunmaktadÕr ve bu bölge son derece korunmuú amino asitlerden oluúan cep topolojisi sergilemektedir. Tüm ȕ-propeller yapÕlarÕnda pervane kanadÕnÕ (blade) oluúturan tüm ȕ- 10 zincirleri birbirine zÕt yönde sÕralanmÕúlardÕr ve I bölgesi ile V bölgesi arasÕnda yaklaúÕk 90° açÕ bulunmaktadÕr. ȕ-propeller (pervane) modulde ȕ-zincirler arasÕndaki dönüúler 310-heliks yapÕsÕndadÕr. ȕ-sandviç modül, 6 tane ȕ-zincirin ikili tabaka úeklinde sÕralanmasÕndan oluúmaktadÕr ve 10 aminoasit artÕ÷Õndan oluúan lup ile katalitik module ba÷lanmaktadÕr. ȕsandviç modül enzimin karbohidrat tanÕmasÕnda rol oynamaktadÕr (Alberto et al., 2004). ùekil 1.2 ønvertaz enziminin üç-boyutlu yapÕsÕ (Lammens et al., 2008) 11 Bitkiler çözünürlükleri, hücresel lokalizasyonlarÕ, optimum pH ve izoelektrik noktalarÕna göre; vakular (Inv-V), hücre duvarÕna ba÷lÕ (InvCW) ve nötral (Inv-N) invertazlar olmak üzere üç çeúit invertaz izoenzimine sahiptirler (Roitsch and González, 2004). Vakular invertazlar ve hücre duvarÕna ba÷lÕ invertazlar benzer enzimatik ve biyokimyasal özelliklere sahiptirler. AyrÕca yüksek derecede benzer dizi homolojileri ile birlikte iki tane korunmuú aminoasit motifleri içerirler. Bu iki invertaz asidik optimum pH’a sahip olup ȕfruktofuranozidaz aktivitesi gösterir. Çünkü sukrozun ve di÷er ȕ-fruktoz içeren oligosakkaritlerin fruktoz artÕklarÕna saldÕrarak hidrolizlerler. Sükroz için Km de÷erleri düúük milimolar aralÕ÷ÕndadÕr. Bunun yanÕnda bu iki invertaz izoenzimi birer N-ba÷lÕ glikoproteindir ve ço÷unlukla molekül kütlesinin 55 ve 70 kDa arasÕ kÕsmÕnÕ karbohidrat kalÕntÕsÕ oluúturur. ønvertaz aktivitesi sülfidril gruplarÕnÕ bloke eden ajanlar (Hg+ ve Ag+) tarafÕndan inhibe edilmektedir. Reaksiyon ürünleri tarafÕndan da inhibe edilirler; glukoz yarÕúmasÕz inhibitör olarak, fruktoz ise yarÕúmalÕ inhibitör olarak etki gösterir. ønvertaz izoenzimleri küçük gen aileleri (iki tane vakular invertaz gen ailesi ve altÕ tane hücre duvarÕna ba÷lÕ invertaz gen ailesi) tarafÕndan kodlanmaktadÕr. Genomik organizasyon ve intronekzon yapÕsÕ monokot ve dikot invertaz genleri arasÕnda korunmuútur. Tüm bitki, bakteri ve fungus invertaz genlerinde var olan çok önemli bir özellik; dokuz tane nükleotitten oluúan küçük bir ekzonun varlÕ÷ÕdÕr. Bu ekzon, N-DPN-G/A kutusu úeklinde üç tane aminoasiti kodlamaktadÕr. WECP/V aminoasit motifinde ise vakular invertazlar valin artÕ÷Õna, hücre duvarÕna ba÷lÕ invertazlar ise valin yerine prolin artÕ÷Õna sahiptir (ùekil 1.3 ve ùekil 1.4). Bu tek aminoasit teki farklanma, hücre duvarÕna ba÷lÕ invertazlarÕn vakular invertazlara göre daha asidik bir pH’a ve farklÕ substrat spesifikli÷ine sahip olmasÕna neden olur (Roitsch and González, 2004; Goetz and Roitsh, 1999). 12 ùekil 1.3 Hücre duvarÕ ve vakular invertazlarÕn aminoasit motifi (Roitsch and González, 2004) ùekil 1.4 Hücre duvarÕ ve vakular invertazlarÕn filogenetik gösterimi (Goetz and Roitsh, 1999) Vakular invertazlar, vakuolda lokalize olup pH 5.0–5.5 arasÕ asidik optimum pH’a sahiptirler. Vakuolar invertazlar, çözünür asidik 13 invertazlar olarak da adlandÕrÕlmaktadÕr. Vakulde depolanan sükrozun seviyesinden ve metabolik prosesler için sükrozun yeniden mobilizasyonundan sorumludurlar. AyrÕca meyve dokularÕnda ve olgun yumrularda karbohidrat dengesinin regülasyonunda görevlidirler (Roitsch and González, 2004). Hücre duvarÕna ba÷lÕ invertazlar ise ekstraselüler, apoplazmik veya periplazmik invertazlar olarak karakterize edilirler. Hücre duvarÕna ba÷lÕ invertazlar düúük optimum pH’a (pH 3.5–5.0) ve yüksek izoelektrik noktaya sahiptirler. Bu tip invertazlar hücre duvarÕna iyonik bir úekilde ba÷lanÕrlar. Sükrozun floemde hidrolizini katalizleyerek yÕkÕm ürünlerinin hücre duvarÕnda bulunan heksoz transporter proteinleri ile floemden stoplazmaya geçmesini sa÷larlar (Roitsch and González, 2004). Üçüncü tip invertazlar olan nötral invertazlar ise, alkali veya stoplazmik invertazlar olarak adlandÕrÕlabilirler. Alkali denmesinin sebebi optimum pH’larÕnÕn pH 6.8–8.0 arasÕnda olmasÕndan, sitoplazmik denmesinin sebebi ise subselüler lokalizasyonun stoplazmada olmasÕndan dolayÕdÕr. Bu tip invertazlar düúük enzim aktivitesine sahip olup aktivitesini hÕzla kaybetti÷inden fizyolojik fonksiyonu hakkÕnda sÕnÕrlÕ bilgi mevcuttur. Bugüne kadar ancak birkaç tane nötral invertaz klonlanÕp karakterize edilmiútir. Asidik invertazlara karúÕ, nötral invertazlar glikozillenmemiútir ve yalnÕzca sükrozu hidrolizlemektedir. Bu sebeple, fruktofuranozidaz de÷ildirler. Nötral invertazlarÕn aktivitesi yÕkÕm ürünlerinden güçlü bir úekilde inhibe olmaktadÕr fakat a÷Õr metal iyonlarÕndan etkilenmemektedir. Nötral invertazlar sadece siyanobakteriler ve bitkilerde bulunmaktadÕr (Roitsch and González, 2004). 14 1.1.2 ønvertazlarÕn etki mekanizmasÕ Spesifik biyokatalizatörler olan enzimler aktivasyon enerjisini düúürerek geçiú haline varmayÕ kolaylaútÕrÕrlar ve geçiú halinin kararlÕlÕ÷ÕnÕ arttÕrarak reaksiyonu hÕzlandÕrÕrlar. Enzimler bunu substrat ba÷lama merkezlerinin spesifikli÷i ve katalitik gruplarÕn optimal düzenleniúi sayesinde baúarÕrlar. Enzimatik kataliz için asit-baz katalizi, kovalent kataliz, metal iyonu katalizi, çözgen katalizi gibi çeúitli mekanizma tipleri önerilmektedir (Uslan, 1997). Ço÷u kaynaktan elde edilen invertazlarÕn kimyasÕ ve kineti÷i hakkÕnda bilgilerin yetersizli÷inden dolayÕ invertaz etki mekanizmasÕna ait çok az gerçek bilinmektedir. Glikozidazlar, çok yaygÕn enzimlerden oluúan bir grup olup çeúitli protein katlanmalarÕ ve substrat spesifiklikleri göstermektedirler. GlikozidazlarÕn hepsinde olan ortak özellik; glikozidik ba÷Õn yÕkÕmÕndan sorumlu katalizle ilgili mekanizmayÕ yapan, kritik bir yerde lokalize olmuú iki tane asidik aminoasit artÕ÷Õna ortak olmalarÕdÕr. Bu de÷iúmez aminoasitler, nükleofilik olarak davranan aspartat ve genel asit-baz gibi davranan glutamattÕr. Glikozidik ba÷Õn enzimatik olarak hidrolizi iki tane stereokimyasal yol (anomerik konfigürasyonun retansiyonu (tutma) yada inversiyonu (tersine çevirme)) ile mümkün olur (Alberto et al., 2004). Retansiyon mekanizmasÕna sahip glikozidazlar, ikili yer de÷iútirme mekanizmasÕyla karbohidrat halkasÕndaki anomerik karbonun konfigürasyonunu koruyarak glikolitik ba÷Õn hidrolizini katalizlerler 15 (ùekil 1.5). Bu enzimler bazen transglukozilleme yetene÷i gösterirler. Bu enzimlerin katalitik mekanizmasÕ; karbohidratÕn bulundu÷u düzlemin iki yanÕnda lokalize olmuú iki tane karboksilik artÕ÷Õn birbirinden ayrÕ kimyasal reaksiyonu gerçekleútirmesine dayanmaktadÕr. ølk adÕmda (glikolizleme); bir karboksilik grup genel-asit katalizi prensibine göre ayrÕlacak grubun koparÕlmasÕnÕ sa÷lar ve hemen eú zamanlÕ olarak ikinci karboksilik grup tarafÕndan nükleofilik bir atak sonucu glikozil-enzim ara ürünü oluúturulur. økinci adÕmda (deglikozilleme); ilk artÕk, genel-baz gibi davranarak gelmekte olan nükleofili (hidroliz reaksiyonu ise su molekülü; transglikozilleme ise alkol) aktive eder ve sonunda karbohidrat hidrolizlenmiú olur. øki karboksilik artÕk arasÕndaki mesafe yaklaúÕk olarak 5 Å kadardÕr (Sinnot, 1990; McCarter and Withers, 1994). ùekil 1.5 GlikozidazlarÕn retensiyon mekanizmasÕ ønversiyon mekanizmasÕna sahip glikozidazlar, tek adÕmlÕ nükleofilik yer de÷iútirme adÕmÕyla anomerik konfigürasyonun ters 16 çevrilmesine neden olurlar. Bu nedenle ȕ-glikozidik ba÷Õn hidroliziyle, ürünler kÕsmÕnda Į-glikozidik ba÷ meydana getirirler veya belirtilenin aksini gerçekleútirirler (ùekil 1.6). Bu katalitik mekanizmaya sahip olan enzimler, ilk adÕmda genel-asit katalizi ile ayrÕlacak grubun ayrÕlmasÕnÕ sa÷layan bir karboksilik artÕk ve ardÕndan genel-baz katalizi ile su molekülünün nükleofilik olarak karbohidrat halkasÕnÕn karúÕ tarafÕna ba÷lanmasÕnÕ sa÷layan ikinci karboksilik artÕ÷Õn yardÕmÕyla glikolitik ba÷Õn hidrolizini gerçekleútirdikleri belirtilmiútir. ønversiyon mekanizmasÕna sahip enzimlerde iki karboksilik artÕk arasÕndaki mesafe retansiyon mekanizmasÕna sahip enzimlerden daha az kÕsÕtlanmÕútÕr ve bu aralÕk 6.5–9.5 Å kadardÕr (Sinnot, 1990, McCarter and Withers, 1994). ùekil 1.6 GlikozidazlarÕn inversiyon mekanizmasÕ ønvertazlarÕn bulundu÷u GH 32 familyasÕ, retansiyon mekanizmasÕna sahiptir (Alberto et al., 2004). Substrat olan karbohidratÕn glikozidik oksijeni asit-baz katalisti(glutamat) tarafÕndan protonlanÕr ve hemen ardÕndan anomerik karbona (fruktozun ȕ-anomerik karbonu) ikinci katalistin (aspartat) nükleofilik ata÷Õ sonucu fruktoz-enzim ara 17 ürünü oluúur. Daha sonra, bu ara ürün hidrolizlenir ve fruktoz ile enzim serbest kalÕr (ùekil 1.7) (Reddy and Maley, 1990). ùekil 1.7 ønvertazÕn sükroz kataliz mekanizmasÕ Enzimlerin reaksiyon mekanizmalarÕnÕn aydÕnlatÕlmasÕnda en önemli adÕm aktif merkezinde yer alan aminoasit yan zincirlerinin ve bunlarÕn konumlarÕnÕn belirlenmesidir. Bu aminoasitler ba÷lanma merkezi ve katalitik merkezde aktif olarak görev alÕrlar. Ço÷u kez XÕúÕnlarÕ yöntemi uygundur fakat en çok kullanÕlan yöntem seçimli olarak reaksiyon veren reaktiflerle yapÕlan modifikasyon çalÕúmalarÕdÕr (Uslan, 1997). Maya kaynaklÕ invertazla yapÕlan CBE ajanÕyla afinite iúaretlenmesi ve site-directed mutagenesis çalÕúmalarÕ sonucunda Asp–23 aminoasidi yerine asparagin aminoasidinin modifiye edilmesiyle enzimin inaktive oldu÷u gözlenmiútir. Sonuç olarak aktif merkezde Asp–23 aminoasidinin bulundu÷u ve nükleofilik olarak etkidi÷i tespit edilmiútir (Reddy and Maley, 1990). Bir baúka çalÕúmada ise yine ayni prosedür ile maya invertazÕnÕn Glu–204 aminoasidinin, alaninle modifiye edilmesi 18 sonucunda katalitik aktivitenin 3000 kat azaldÕ÷Õ görülmüútür. Glu–204 artÕ÷ÕnÕn proton donorü olarak davranmasÕnÕn anlaúÕlmasÕ ile bu artÕ÷Õn invertazÕn katalitik aktivitesi için esansiyel oldu÷u belirtilmiútir. AyrÕca iyodin inaktivasyonuyla yapÕlan çalÕúmada Cys–205 artÕ÷ÕnÕn bloke edilmesi hidroliz reaksiyonunu % 70 oranÕnda düúürmektedir. Bunun sonucunda, Cys–205 artÕ÷ÕnÕn, Glu–204 artÕ÷Õna yakÕn olmasÕndan dolayÕ katalize uygun bir çevre yaratabildi÷i ya da substrat ba÷lanmasÕnda görev alabilece÷i belirtilmiútir (Reddy and Maley, 1996). Arabidopsis thaliana hücre duvarÕ invertaz-1 (AtcwINV1) mutantlarÕnÕn sükroz molekülü ile oluúturduklarÕ kompleksin kristal yapÕsÕ X-ÕúÕnlarÕ ile yapÕlan çalÕúmada do÷al AtcwINV1 invertazÕnÕn aktif bölgesi ile ilgili ayrÕntÕlarÕ daha iyi anlamada yardÕmcÕ olmuútur. E203Q AtcwINV1 mutantÕnÕn yapÕsÕ yeni bir ba÷lama tarzÕnÕ ortaya koymuútur. Di÷er enzim-sükroz komplekslerine kÕyasla fruktoz artÕ÷Õ neredeyse ayni pozisyonda kalÕr iken glukoz altbiriminin oryantasyonunda farklÕlÕklar oldu÷u görülmüútür. Buna göre D23A, E203A ve D239A aminoasitleri aktif merkezde bulunmaktadÕr. Bunun yanÕnda W20, W47 ve W82 diye adlandÕrÕlan üç tane triptofan aminoasiti hidrofobik bölgeyi, N22 (asparagin), D23 (aspartat), R148 (argin), E203(glutamat), D149 ve D239 aminoasit artÕklarÕ ise ideal bir sükroz ba÷layan cebi oluúturmaktadÕr. D239 artÕ÷Õ sükrozun glukoz artÕ÷Õ ile direkt olarak ba÷lanÕrken, K242 (lizin) artÕ÷Õ indirekt bir yolla substrat stabilizasyonu sa÷layarak D239 artÕ÷ÕnÕn substrat ba÷lamasÕ için onu uygun bir pozisyonda tuttu÷u belirtilmiútir (ùekil 1.8) (Lammens et al., 2008). 19 ùekil 1.8 Arabidopsis thaliana invertazÕnÕn kristal yapÕsÕ Thermotoga maritima invertazÕnÕn kristal yapÕsÕ X-ÕúÕnlarÕ kristalografisi ile aydÕnlatÕlmÕútÕr. Aktif merkezinde glutamat, aspartat, triptofan, serin, tirozin, arginin ve asparagin aminoasitlerinin bulundu÷u belirlenmiútir (Alberto et al., 2004). Thermotoga maritima invertazÕnÕn do÷al substratÕ olan rafinoz molekülü ile oluúturdu÷u kompleksin kristal yapÕsÕ da aydÕnlatÕlmÕú ve 3-boyutlu yapÕ substrat spesifikli÷inin anlaúÕlmasÕnda yardÕmcÕ olmuútur. Rafinoz molekülü ȕ-propeller modül içerisinde -1, +1 ve +2 olarak adlandÕrÕlan ba÷lanma bölgelerine ba÷lanmaktadÕr ve ȕ-fruktofuranozil birimi -1 bölgesinde katalize girmektedir. Fruktoz artÕ÷Õ aktif merkezin -1 bölgesinin iç kÕsmÕna lokalize olmuú ve Trp260, Trp41, Gln33, Asn16 ve Asp138 artÕklarÕnÕn hidroksil gruplarÕ ile hidrojen ba÷Õ oluúturmuútur. Bu bölge substratÕn ba÷lanmasÕndan ve fruktoz artÕ÷ÕnÕn koparÕlmasÕndan sorumludur. Rafinozun Į-glukoz artÕ÷Õ +1 bölgesinde Trp65, Phe74 ve Trp260 aromatik aminoasitleri tarafÕndan sarÕlmÕútÕr. Bu hidrofobik etkileúimler rafinozun aktif merkeze ba÷lanmasÕnÕ adapte etmektedir. Rafinozun terminal 20 galaktoz birimi ise +2 bölgesinde yer almÕútÕr. Bu bölge aktif merkezin proteinin yüzeyine yakÕn oldu÷u yerde yer almaktadÕr ve Glu101 ile Tyr92 artÕklarÕ bu bölgede sÕrasÕyla glukoz artÕ÷Õ ve su molekülleri ile hidrojen ba÷larÕ oluúturmaktadÕr (ùekil 1.9) (Katalitik artÕklar sarÕ renk; aromatik artÕklar mavi; di÷er artÕklar yeúil; Qw su moleküllerini; (- - -) ise hidrojen ba÷larÕni göstermektedir) (Alberto et al., 2006). ùekil 1.9 Thermotoga maritima invertazÕnÕn kristal yapÕsÕ 1.1.3 ønvertazlarÕn izolasyonu ve saflaútÕrÕlmasÕ Protein olarak enzimler çok çeúitli biyokimyasal teknikler kullanÕlarak izole edilip saflaútÕrÕlabilirler. SaflaútÕrmanÕn amacÕ daha sonraki çalÕúmalarda kullanÕlabilecek uygun bir protein preparatÕnÕn hazÕrlanmasÕdÕr. Bunun için öncelikle gereksinim duyulan protein miktarÕ, ne düzeyde bir saflÕk istendi÷i, ne düzeyde bir aktivite kaybÕnÕn tolere edilebilece÷i, ne kadar zaman ve para harcanabilece÷i belirlenmelidir. SaflaútÕrÕlacak olan enzim seçilen kaynakta hem kararlÕ olmalÕ hem de bol miktarda bulunmalÕdÕr. AyrÕca kolay sa÷lanabilir, bol 21 ve ucuz kaynaklar daima tercih edilirler. Enzimlerin izolasyon ve saflaútÕrÕlmasÕnda her zaman en etkili, en hÕzlÕ ve en ekonomik prosesler belirlenmeye çalÕúÕlÕr. øzolasyon adÕmÕnda genellikle homojenizasyon ve homojenatÕn separasyonu gerçekleútirilir. SaflaútÕrmanÕn ilk adÕmlarÕnda daha çok deriútirme yöntemleri, daha sonra ise kromatografik teknikler kullanÕlÕr (Telefoncu, 1996). ønvertaz kayna÷Õ olarak mikrobiyal ve bitkisel kaynaklar seçilerek, bilinen ekstraksiyon yöntemleri ile enzim izole edilip, saflaútÕrÕlmÕú ve saflaútÕrÕlan bu enzim karakterize edilerek çeúitli uygulama alanlarÕna sunulmuútur. ønvertazlar genellikle hücre içerisinde ve de di÷er çeúitli glikozidazlarla bir arada bulunurlar. O nedenle bu aktiviteleri ço÷u kez birbirinden ayÕrmak oldukça zor olmaktadÕr. øzolasyon ve saflaútÕrmada kullanÕlan teknikler; amonyumsülfat ve organik çözgen ile fraksiyonlama, ÕsÕ muamelesi, asidifikasyon, iyon de÷iúim, jel kromatografisi ve izoelektirik fokuslama olarak sÕralanabilir. Oldukça yüksek saflÕkta ve hemen hemen homojen bir invertaz preparatÕnÕn hazÕrlanabildi÷i çok az çalÕúma mevcuttur. Enzimin ilk kristal formu, termofilik bir bakteri olan Thermotoga maritima ’dan izole edilen invertazdÕr (Alberto et al., 2004). Literatürlerde verilen invertaz izolasyon, saflaútÕrma ve karakterizasyon çalÕúmalarÕnda bitkisel kaynak olarak zambak (Singh and Knox, 1983; Miller and Ranwala, 1994), úeker kamÕúÕ (Vorster and Botha, 1998), armut (Hashizume et al., 2003), patates (Isla et al., 1998), so÷an (Benkeblia et al., 2004), üzüm (Dreier et al., 1998), tütün (Rojo et al., 1998), soya fasulyesi (Morell ve Copeland, 1983), kavun (Lingle and Dunlap, 1987), bambu (Liu et al., 2006), úeker pancarÕ (Leigh et al.,1978), papaya (Lopez et al.,1988), domates (Nakagawa et al.,1971), enginar (Goupil et al., 1988), portakal (Schaffer, 1986), bu÷day 22 (Krishnan et al.,1985), Latin çiçe÷i (Isla et al. 1988), hint ya÷Õ bitkisi (Prado et al., 1985), turp (Faye et al., 1981), yulaf (Pressey and Avants, 1980), havuç (Lee and Sturm, 1996), úeftali (Moriguchi et al., 1991), arpa (Obenland et al., 1993), nohut (Asthir and Singh, 1997), mango (Rahman et al., 2001), pirinç (Fu et al., 2003), mung bean (Yun et al., 2002), semizotu (Abdou, 2004) ve elma (Pan et al., 2005), mikrobiyal kaynak olarak Candida utilis (Chávez et al., 1997; Belcarz et al., 2000), Lactobacillus reuteri (Ginés et al., 2000), Kluyveromyces fragilis (Workman and Day, 1983), Aspergillus niger (L’Hocine et al., 2000), Schwanniomyces occidentalis (Álvaro-Benito et al., 2007), Arthrobacter globiformis (Win et al., 2004), Rhodotorula glutinis (Rubio et al., 2002), Schizosaccharomyces pombe (Tanaka et al., 1998), Clostridium perfringens (Ishimoto and Nakamura, 1997), Saccharomyces cerevisiae (Bahar ve Tuncel, 2004; Bansal-Mutalik and Gaikar, 2005), Fusarium oxysporum (Nishizawa et al., 1980), Pycnoporus sanguineus (Quiroga et al., 1995), Aspergillus nidulans (Chen et al., 1996), Aspergillus ochraceus (Ghosh et al., 2001) ve Bifidobacterium infantis (Warchol et al., 2002) seçilmiútir. Bu kaynaklardan izole edilen invertazlar, genellikle tuz çöktürmesi (Vorster and Botha, 1998; Singh and Knox, 1983), organik çözgen ile fraksiyonlama (Chávez et al., 1997; Bansal-Mutalik and Gaikar, 2005), anyon yada katyon de÷iúim kromatografisi (Hashizume et al., 2003; Ginés et al., 2000), afinite kromatografisi (Bahar ve Tuncel, 2004; Rahman et al., 2001; Belcarz et al., 2000), jel filtrasyon kromatografisi (L’Hocine et al., 2000; Álvaro-Benito et al.,, 2007) ve izoelektrik fokuslama (Workman and Day, 1983; Liu et al., 2005) kullanÕlarak saflaútÕrÕlmÕútÕr. SaflaútÕrÕlan invertazlar baúta biyoteknolojik prosesler olmak üzere birçok alanda uygulama imkanÕ bulmuútur (Rubio et al., 2002; Win et al., 2004). 23 1.1.4 ønvertazlarÕn fiziksel özellikleri 1.1.4.1 ønvertazlarÕn multimoleküler formlarÕ ve molekül kütleleri Genel olarak proteinlerin saflÕ÷ÕnÕn kontrolü, saf proteinin alt birim yapÕlarÕnÕn incelenmesi ve molekül kütlesi tayini için poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) yöntemlerinden yararlanÕlmaktadÕr. Poliakrilamid jel elektroforezinin en yaygÕn olarak kullanÕlanÕ Laemmli tarafÕndan geliútirilen Sodyum Dodesil Sülfat PoliAkrilamid Jel Elektroforezidir (SDS-PAGE) (Laemmli, 1970). SDS-PAGE ile proteinler biyolojik ve biyokimyasal aktivitelerini yitirdikleri için bu durumda do÷al koúullar altÕnda elektroforez (PAGE) tercih edilmektedir. Proteinlerin moleküler kütlelerinin belirlenmesinde kullanÕlan SDS-PAGE’ne alternatif bir metod da moleküler boyuta göre ayÕrma yapan jel filtrasyon kromatografisidir (Zihnio÷lu, 1996). ønvertazlarÕn moleküler kütleleri ve yapÕlarÕ kaynaktan kayna÷a ve kullanÕlan tayin yöntemine ba÷lÕ olarak farklÕlÕk göstermektedir. Örne÷in; mango invertazÕnÕn molekül kütlesi jel filtrasyon kromatografisi ve SDSPAGE ile sÕrasÕyla 68 kDa ve 65.5 kDa olarak belirlenmiúir (Rahman et al., 2001). Rhodotorula glutinis invertazÕnÕn molekül kütlesi SDS-PAGE ile 47 kDa, jel fitrasyonu ile 100 kDa olarak bulunmuú ve enzimin iki identik alt birime sahip oldu÷u belirtilmiútir (Rubio et al., 2002). Woodfordia fruticosa invertazÕnÕn molekül kütlesi jel filtrasyonu ile 280 kDa olarak bulunmuú ve enzimin SDS-PAGE ile 66 kDa, 43 kDa ve 40 kDa molekül kütlesine sahip heterotrimerik bir protein oldu÷u belirlenmiútir (Weersaooriya and Yatawara, 2002). ùeker kamÕúÕ nötral invertazÕnÕn 60 kDa molekül kütlesine sahip monomeri oldu÷u ve 24 monomer, dimer ve tetramer olarak katalitik aktivite gösterdi÷i tespit edilmiútir (Vorster and Botha, 1998). Fusarium oxysporum invertazÕnÕn invertaz P-1 ve invertaz P-2 olarak iki formu bulundu÷u ve bu iki enzimin SDS-PAGE ile molekül kütleleri sÕrasÕyla 108 kDa ve 84 kDa oldu÷u belirlenmiútir (Nishizawa et al., 1980). Ricinus communis ’dan saflaútÕrÕlan invertazÕn ise homoheptamerik bir protein olup her bir alt birimin 11 kDa oldu÷u SDS-PAGE ile belirlenirken, jel filtrasyonu ile 78 kDa molekül kütlesine sahip oldu÷u belirlenmiútir (Prado et al., 1985). Havuç invertazÕnÕn alkali invertaz ve nötral invertaz olmak üzere iki formu mevcuttur. Alkali invertazÕ homotetramerik bir protein olup her bir alt birimin 126 kDa oldu÷u SDS-PAGE ile belirlenirken, jel fitrasyonu ile 504 kDa molekül kütlesine sahip oldu÷u hesaplanmÕútÕr. Nötral invertazÕ ise homooktamerik bir protein olup her bir alt birimin 57 kDa oldu÷u SDS-PAGE ile belirlenirken, jel filtrasyonu ile 464 kDa molekül kütlesine sahip oldu÷u bulunmuútur (Lee and Sturm, 1996). Çizelge 1.2’de çeúitli kaynaklardan izole edilerek saflaútÕrÕlan invertazlarÕn molekül kütleleri verilmiútir. Clostridium perfringens Schizosaccharomyces pombe Woodfordia fruticosa Fusarium oxysporum Ricinus communis Daucus carota Beta vulgaris ønvertaz Kayna÷Õ Candida utilis Lactobacillus reuteri CRL 1100 Lilium auratum ùeker kamÕúÕ Armut Aspergillus niger AS0023 Aspergillus niger IMI303386 Candida utilis Rhodotorula glutinis Solanum tuberosum Nicotiana glauca Bambusa edulis Mango 37 1070 280 108 – 84 11 126 – 57 28 ønvertaz ønvertaz P–1 ve ønvertaz P–2 Vakular invertaz Alkali invertaz ve Nötral invertaz Periplazmik invertaz Periplazmik invertaz Periplazmik invertaz Molekül Kütlesi (kDa) 150 58 450 60 80 – 86 91 125 62 – 280 100 72 – 72 89,3 240 – 68 65 ønvertaz Periplazmik ønvertaz ønvertaz ønvertaz–1 (sitoplazmik) Nötral invertaz (SNI) AIV I - AIV II INV ønvertaz F-formu ve S-formu ønvertaz Vakular invertaz - ønvertaz I Vakular invertaz IT I - IT II ønvertaz Referans Chávez et al., 1997 Ginés et al., 2000 Singh and Knox, 1983 Vorster and Botha, 1998 Hashizume et al., 2003 L’Hocine et al., 2000 Nguyen et al., 2005 Belcarz et al., 2002 Rubio et al., 2002 Isla et al., 1999 Rojo et al., 1998 Liu et al., 2006 Rahman et al., 2001 Weersaooriya Jel filtrasyonu and Yatawara, 2002 SDS-PAGE Nishizawa et al., 1980 SDS-PAGE Prado et al., 1985 SDS-PAGE Lee and Sturm, 1996 Jel filtrasyonu Masuda et al., 1980 Ishimoto Jel filtrasyonu and Nakamura, 1997 PAGE Moreno et al., 1990 Yöntem SDS-PAGE SDS-PAGE Jel filtrasyonu Jel filtrasyonu SDS-PAGE SDS-PAGE SDS-PAGE PAGE Jel filtrasyonu Jel filtrasyonu Jel filtrasyonu Jel filtrasyonu Jel filtrasyonu Çizelge 1.2 BazÕ invertazlarÕn molekül kütleleri. 25 26 1.1.5 ønvertazlarÕn kinetik özellikleri 1.1.5.1 ønvertazlarÕn aktivitesine substrat konsantrasyonunun etkisi ve substrat spesifiklikleri ønvertazlarÕn enzimatik aktivitelerinin tayininde do÷al substratlar kullanÕlmaktadÕr. Sükroz, rafinoz, metil-fruktofuranozid, benzilfruktofuranozid, stakiyöz ve verbaskoz gibi oligosakkaritler ve inulin gibi polimerler invertaz aktivitesi tayininde kullanÕlan do÷al substratlardÕr. ønvertazlar sükrozu, glukoz ve fruktoza hidrolizlerken rafinoz, stakiyöz ve verbaskozun terminal indirgen olmayan fruktoz artÕ÷ÕnÕ da hidrolizlemektedir (ùekil 1.10). ønvertazlar, fruktozun yarÕúmalÕ inhibisyonu ve glukozun non-kompetitif inhibisyonu ile etkilenmektedirler. ùekil 1.10 ønvertazÕn do÷al substratlarÕ 27 Genellikle glikozid substratlarÕnÕn tek bir atomundaki hidrojen ve hidroksil gruplarÕnÕn konfigürasyonlarÕndaki de÷iúme, ilgili hidrolazÕn hidrolitik karakterini ya tamamen inhibe eder yada hÕzÕ düúürür. ønvertazlarda substratÕn hidroliz hÕzÕna etki eden iki faktör vardÕr. Bunlardan birincisi, halka yapÕsÕ fruktofuranoid yapÕda olmalÕ, ikincisi ise substratÕn H ve OH gruplarÕnÕn konfigürasyonu fruktoza benzerlik göstermelidir. Literatürlerde belirtildi÷i gibi invertazlarÕn substratlara olan afinitesini (1/Km), substratlarÕn yapÕlarÕndaki de÷iúimlerle birlikte invertazÕn aktif merkezinde substratÕn ba÷lanmasÕ ve glikozidik ba÷Õn yÕkÕmÕndan sorumlu olan aminoasitlerin kompozisyonu da invertazÕn substrat spesifikli÷ine ve kataliz hÕzÕna etki eden en önemli faktörlerdendir. Neredeyse tüm invertazlarda çok yüksek derecede korunmuú ve ortak olan NDPNG, EC ve RDP motifleri sÕrasÕyla aspartat, glutamat ve aspartat aminoasitlerini barÕndÕrmaktadÕr ve bu aminoasitler katalitik reaksiyonda çok önemli fonksiyona sahiptir. Fakat bu aminoasitlerin çevresindeki artÕklarÕn pozisyonu da substrat ba÷lanmasÕnda ve katalizde direk veya indirek olarak rol oynamaktadÕr (Lammens et al., 2008). Çizelge 1.3’de çeúitli kaynaklardan saflaútÕrÕlan invertazlarÕn substrat spesifiklikleri ile ilgili sonuçlar verilmiútir. Ekstraselüler invertaz Ǻ-FFaz-E Aspergillus ochraceus TS Lycopersicon esculentum Ǻ-FFaz-L Ekstraselüler invertaz ønvertaz II ønvertaz I ønvertaz III Beta vulgaris Avena sativa Nötral invertaz ønvertaz I Cicer arietinum Lilium longiflorum ønvertaz II ønvertaz ønvertaz Substrat Sükroz ønulin Rafinoz Sükroz Sükroz Rafinoz Sükroz Rafinoz Sükroz Rafinoz Sükroz Rafinoz Stakiyöz Sükroz Rafinoz Stakiyöz Sükroz Rafinoz Sükroz Rafinoz Sükroz Rafinoz Sükroz Rafinoz Km (mM) 64.0 19.0 15.0 14.2 1.0 1.6 6.4 10.8 6.6 13 2.4 2.9 14.0 6.7 17.0 25.0 1.33 4.0 3.5 4.5 2.17 20.4 3.7 10.6 Nakagawa et al., 1971 Ghosh et al., 2001 Masuda and Sugawara, 1980 Pressey and Avants, 1980 Asthir and Singh, 1997 Miller and Ranwala, 1994 Referans Liebl et al., 1998 Çizelge 1.3 ønvertazlarÕn substrat spesifiklikleri. ønvertaz Kayna÷Õ Thermotoga maritima 28 ønvertaz ønvertaz ønvertaz Asit invertaz Ekstraselüler invertaz ønvertaz øntraselüler invertaz ønvertaz ønvertaz Asit invertaz ønvertaz Kayna÷Õ Ipomoea batatas Pycnoporus sanguineus Tropaeolum majus Clostridium perfringens Saccharomyces cerevisiae Zymomonas mobilis Woodfordia fruticosa Rhodotorula glutinis Saccharum officinarum Substrat Sükroz Rafinoz Sükroz Rafinoz Stakiyöz Sükroz Rafinoz Stakiyöz Sükroz Sükroz Sükroz Sükroz Sükroz Sükroz Km (mM) 10.69 32.19 4.89 9.3 18.8 5.3 17.0 25.0 0.05 41.2 42.0 160.0 227.0 67 Çizelge 1.3 (devam) Ishimoto and Nakamura, 1997 Arruda and Vitolo, 1999 Ait-Abdelkader et al., 2000 Weersaooriya and Yatawara, 2002 Rubio et al., 2002 Batta et al., 1991 Isla et al., 1988 Quiroga et al., 1995 Referans Huang et al., 2003 29 30 YapÕlan çalÕúmalarda, farklÕ kaynaklardan saflaútÕrÕlan invertazlarÕn çeúitli substratlara karúÕ farklÕ spesifiklik gösterdikleri belirlenmiútir (ùekil 1.11). Carica papaya invertazÕ oldukça geniú substrat spesifikli÷ine sahiptir. Enzimin ȕ-metil fruktozid, rafinoz, sükroz ve stakiyözu hidrolizleyebildi÷i belirlenmiútir (Lopez et al., 1988). Pycnoporus sanguineus invertazÕ ise sükroz, rafinoz, stakiyöz, inulin ve levanÕ hidrolizleyebilmektedir (Quiroga et al., 1995). Nicotiana tabacum invertazÕ ise baúta sükroz olmak üzere rafinoz, melezitoz ve trehaloza spesifiklik gösterek terminal fruktozil artÕklarÕndan hidrolizleyebilmektedir (Nakamura et al., 1988). Aspergillus japonicus TIT-KJ1 ȕ-fruktofuranozidazÕ sükroz, rafinoz, nistoz yanÕnda 1-kestozu da hidrolizlemektedir (Duan et al., 1993). ùekil 1.11 ønvertazlarÕn do÷al substratlarÕ Bifidobacterium lactis DSM 10140T rekombinant ȕfruktofuranozidazÕnÕn çeúitli fruktooligosakkaritler üzerine etkisi araútÕrÕlmÕútÕr. Enzim fruktoz artÕklarÕ arasÕndaki beta 2-1 glikozidik 31 ba÷larÕna yüksek ilgi göstermektedir. Raftiloz (ȕ-D-Fru-(1–2)-(ȕ-D-Fru)n [n=5]), Raftilin LS (ȕ-D-Glu-(1–2)- (ȕ-D-Fru)n [n=10]) ve sükroza karúÕ elde edilen Km de÷erleri sÕrasÕyla 0.12, 7.08 ve 8.37 mM olarak bulunmuútur. Rafinoz (ȕ-D-Gal-(1–6)-ȕ-D-Glu-(1–2)-ȕ-D-Fru), Raftilin HP (ȕ-D-Glu-(1–2)-(ȕ-D-Fru)n [n=23]) ve levan (ȕ-D-Fru-(2–6)-(ȕ-DFru)n) oligosakkaritlerine karúÕ ise oldukça düúük aktivite gösterirken melezitoza (ȕ-D-Glu-(1–3)-ȕ-D-Fru-(2–1)-ȕ-D-Glu) karúÕ hiç aktivite göstemedi÷i belirtilmiútir (Janer et al., 2004). Zymomonas mobilis intraselüler invertazÕ (SacA) sükroz (glukozilĮ-1ĺ2-ȕ-fruktozid) ve rafinoza (galaktozil-Į-1ĺ6-glukozil-Į-1ĺ2-ȕfruktozid) karúÕ oldukça yüksek bir aktivite göstererek yapÕlarÕndaki ȕ2ĺ1 frukozil ba÷Õndan parçalamaktadÕr. Ancak maltoz (glukozil-Į-1ĺ4ȕ-glukozid) ve levan (ȕ-2ĺ6 polifruktozid) karbohidratlarÕnÕ hidrolizleyemezken inulini (ȕ-2ĺ1 polifruktozid) çok düúük bir aktivite ile hidrolizleyebilmektedir (Aït-Abdelkader et al., 2000). Thermotoga maritima invertazÕ fruktozil artÕ÷Õ içeren sukrozun yanÕnda rafinoz gibi oligosakkaritlerde ve inulin gibi polisakkaritlerde terminal indirgen olmayan fruktozil artÕ÷ÕnÕ kolaylÕkla hidrolizleyebilmektedir. Ancak nistoz, kestoz ve inulin polimerinin türevleri gibi yüksek zincirli fruktoz polimerleri enzimin aktif merkezine ba÷lanamadÕ÷Õndan hidrolizlenememektedir (Alberto et al., 2006). 1.1.5.2 ønvertaz aktivitesi ve kararlÕlÕ÷Õna sÕcaklÕ÷Õn etkisi Tüm kimyasal reaksiyonlar gibi, enzim katalizli reaksiyonlar da sÕcaklÕ÷a ba÷ÕmlÕdÕr ve reaksiyonun hÕzÕ sÕcaklÕkla artÕú gösterir. Fakat bu artÕú sürekli de÷ildir. Özellikle 40oC’nin üzerinde inkübasyon süresine 32 ba÷ÕmlÕ olarak önce bir duraklama daha sonrada gerileme gösterir. Ana yapÕsÕ protein olan enzimler sÕcaklÕkla denaturasyona u÷rarlar. Belirli çalÕúma koúullarÕnda farklÕ sÕcaklÕklarda enzimin maksimum aktivite gösterdi÷i sÕcaklÕ÷a optimum sÕcaklÕk denir. Optimum sÕcaklÕk inkübasyon süresine ba÷ÕmlÕ bir parametredir (Telefoncu, 1986). ønvertazlar da kaynaklarÕna ba÷lÕ olarak çeúitli kararlÕlÕk dereceleri gösterirler. Genellikle invertazlarÕn ço÷unun optimum sÕcaklÕk de÷eri 4050oC arasÕnda de÷iúmektedir. Fakat mikrobiyal kaynaklÕ termostabil invertazlar için bu de÷er 50oC’nin çok üstüne de çÕkabilmektedir. Örne÷in; Thermotoga maritima (Liebl et al., 1998), Candida utilis (Belcarz et al., 2002), Corticium rolfsii (Sato and Kaji, 1976), Nicotiana tabacum (Nakamura et al., 1988), Aureobasidium pullulans (Oliveira and Park, 1995) için optimum sÕcaklÕk de÷erleri sÕrasÕyla 90, 70, 75, 60 ve 55oC olarak belirlenmiútir. Thermotoga maritima invertazÕ, invertazlar arasÕnda bugüne kadar bilinen en yüksek oranda termoaktif ve termokararlÕlÕ÷a sahip invertaz olarak tanÕmlanmÕútÕr. Enzimin 30oC’nin altÕnda aktivite göstermezken, 60-98oC aralÕ÷Õnda inkübe edildi÷inde oldukça termostabil oldu÷u gözlenmiútir. Enzimin optimum sÕcaklÕ÷Õ 90oC olarak belirlenmiútir. 98oC ve üzerindeki sÕcaklÕklarda enzim inaktive olmaktadÕr. SÕcaklÕ÷Õn enzim kararlÕlÕ÷Õna etkisi incelendi÷inde, 60oC’de 14 gün inkübasyon sonucu enzim baúlangÕç aktivitesinin % 60’ÕnÕ, 70oC’de 14 gün inkübasyon sonucu enzim baúlangÕç aktivitesinin % 76’ÕnÕ kaybetmektedir. 80 ve 85oC’de 5 saat inkübasyon sonucu enzim baúlangÕç aktivitesinin % 85’ini koruyabilmektedir. Bu özelliklerinden dolayÕ Thermotoga maritima invertazÕnÕn yüksek sÕcaklÕklarda çalÕúan prosesler içi uygun olabilece÷i öne sürülmüútür (Liebl et al., 1998). 33 Corticium rolfsii invertazÕ için optimum sÕcaklÕk de÷eri 75oC olup enzim pH 4.0’de kararlÕdÕr. 50oC’de aktivitesinin % 50’sini, 80oC’de ise aktivitesinin % 70’ini göstermektedir. 65oC’de 10 dakika inkübasyona maruz kaldÕ÷Õnda % 100 aktivitesini korurken, 70oC’de % 90’ÕnÕ koruyabilmektedir (Sato and Kaji, 1976). Candida utilis invertazÕnÕn S- ve F- formu için optimum sÕcaklÕk 70oC olarak belirlenmiútir. Her iki formuda 30-90oC arasÕndaki sÕcaklÕk de÷iúimlerine karúÕ oldukça yüksek dayanÕklÕlÕ÷a sahiptir. 30oC’de Fformu baúlangÕç aktivitesinin % 80’ini, S-formu ise % 75’ini korurken, 80oC’de F-formu baúlangÕç aktivitesinin % 45’ini, S-formu ise yalnÕzca % 2’sini kaybetmiútir (Belcarz et al., 2002). Aspergillus japonicus TIT-KJ1 invertazÕ 40oC ve 70oC’de baúlangÕç aktivitesinin % 30’unu korurken, optimum sÕcaklÕ÷Õ olan 60oC’de aktivitesinin % 100’ünü göstermektedir. pH 5.4 ve 37oC’de 2 saat boyunca kararlÕ iken pH 5.4 ve 56oC’de ancak 20 dakika kararlÕ kalabilmektedir (Duan et al., 1993). Cladosporium cladosporioides invertazÕ 40-75oC sÕcaklÕk aralÕ÷Õnda baúlangÕç aktivitesinin en az % 40’ÕnÕ korurken, 60 C’de 20 saat boyunca kararlÕlÕ÷ÕnÕ koruyabilmektedir (Ferreira et al., 1991). o Lilium longiflorum invertazlarÕndan invertaz I, invertaz II ve invertaz III için optimum sÕcaklÕklar sÕrasÕyla 40, 50 ve 45oC olarak belirlenmiútir. Bu enzimler 60oC’de 10 dakika süreyle inkübasyona maruz bÕrakÕldÕ÷Õnda, invertaz I enzimi aktivitesini tamamen kaybederken, invertaz II ve invertaz III enzimleri baúlangÕç aktivitelerinin sÕrasÕyla % 25 ve % 40’ÕnÕ koruyabilmiúlerdir (Miller and Ranwala, 1994). 34 Saccharum officinarum ve mango invertazÕnÕn 10-75oC arasÕnda termal kararlÕlÕ÷a sahip olduklarÕ ve optimum sÕcaklÕklarÕnÕn sÕrasÕyla 40oC ve 75oC oldu÷u belirtilmiútir. Saccharum officinarum invertazÕ 50oC’ye kadar kararlÕlÕ÷ÕnÕ korurken, bu sÕcaklÕktan yüksek sÕcaklÕklarda dönüúümü olmayan denaturasyona u÷ramaktadÕr. Mango invertazÕ ise 75oC’de 15 dakika inkübasyona maruz kaldÕ÷Õnda baúlangÕç aktivitesinin % 95’ini koruyabilmiútir (Batta et al., 1991; Rahman et al., 2001). Aspergillus niger AS0023 invertazÕnÕn 30-70oC aralÕ÷Õnda oldukça termostabil oldu÷u gözlenmiútir. Enzimin optimum sÕcaklÕ÷Õ 55oC olarak belirlenmiútir. Aspergillus niger AS0023 invertazÕ 65oC’de 2 saat inkübe edildi÷inde baúlangÕç aktivitesinin % 80’ini koruyabilmektedir (L’Hocine et al., 2000). Rhodotorula glutinis invertazÕnÕn 60oC’de dahi ÕsÕya dayanÕklÕ bir enzim oldu÷u ve de endüstriyel alanda úurup üretimi için gerekli ÕsÕ úartÕnÕ sa÷ladÕ÷Õ için kullanÕmÕnÕn uygun oldu÷u belirtilmiútir (Rubio et al., 2002). Çizelge 1.4’de çeúitli invertazlarÕn termal kararlÕlÕklarÕ ile ilgili bazÕ sonuçlar verilmiútir. 35 Çizelge 1.4 BazÕ invertazlarÕn termal kararlÕlÕklarÕ. ønvertaz Kayna÷Õ Thermotoga maritima SÕcaklÕk (oC) Zaman Aktivite KaybÕ (%) 60 14 gün 60 Corticium rolfsii 70 10 dk 10 Mango Aspergillus niger AS0023 75 15 dk 5 65 2 saat 20 Candida utilis Bifidobacterium infantis 80 15 dk 2 50 30 dk 10 Referans Liebl et al., 1998 Sato and Kaji, 1976 Rahman et al., 2001 L’Hocine et al., 2000 Belcarz et al., 2002 Warchol et al., 2002 1.1.5.3 ønvertaz aktivitesi ve kararlÕlÕ÷Õna pH’Õn etkisi Enzimlerin aktivitesini etkileyen en önemli faktörlerden birisi pH’dÕr. ønkübasyon ortamÕnÕn pH’sÕ, protein molekülünün tamamÕnÕn yük ve dissosiasyon durumu yanÕnda aktif merkezi de etkilemektedir. pH etkisi özellikle úu sonuçlara neden olmaktadÕr; enzim proteinin tersinir olmayan denaturasyonu ve optimum pH bölgesi dÕúÕnda koenzim veya prostetik gruplarÕn aktif merkezden ayrÕlmasÕ. Enzimlerin maksimum aktivite gösterdikleri pH, optimum pH’dÕr. H+ iyonu konsantrasyonundaki de÷iúme özellikle aktif merkezinde asidik veya bazik gruplar taúÕyan enzimler, hidrolazlar için çok önemlidir ve enzimin aktivite gösterdi÷i pH skalasÕ da oldukça dardÕr (Telefoncu, 1986). ønvertazlarÕn optimum pH de÷erleri kullanÕlan enzim kayna÷Õna, substrat, inkübasyon zamanÕ ve sÕcaklÕ÷Õna göre oldukça geniú bir 36 aralÕkta farklÕlÕk göstermektedir. BazÕ invertazlar iki optimum pH piki verirken ço÷u tek bir optimum piki verir. ønvertazlarÕn ço÷u oldukça geniú bir pH aralÕ÷Õnda (pH 2.0–9.0) kararlÕdÕr. Vakular invertazlar pH 5.0–5.5, ekstraselüler invertazlar pH 3.5–5.0 ve alkali invertazlar ise pH 6.8–8.0 arasÕnda pH optimumu verirler. Aúa÷Õda çeúitli invertazlarla yapÕlan çalÕúmalar sonucu elde edilen optimum pH ve pH kararlÕlÕk verileri sunulmuútur. ønvertaz aktivitesine pH’nÕn etkisinin anlaúÕlmasÕ, bu pH etkisinin enzim kayna÷Õ ve substrata göre de÷iúiminin incelenmesi açÕsÕndan oldukça önemlidir. Daucus carota invertazlarÕndan nötral invertazÕ pH 4.8–8.0 aralÕ÷Õnda, alkali invertazÕ ise pH 7–9 aralÕ÷Õnda geniú bir optimuma sahiptir (Lee and Sturm, 1996). Lilium auratum invertazlarÕndan invertaz-1 pH 3-5.4 aralÕ÷Õnda, invertaz-2 ise pH 4.8-7.4 gibi oldukça yaygÕn bir aralÕkta kararlÕdÕr. ønvertaz-1 ve invertaz-2 enzimlerinin optimum pH’Õ ise sÕrasÕyla pH 4.0 ve pH 5.4 olarak belirlenmiútir (Signh and Knox, 1985). Lycopersicon esculentum invertazlarÕndan sükrozun hidrolizini katalizleyen formu pH 3.6’de optimum gösterirken pH 2.7–5.7 gibi oldukça yaygÕn bir aralÕkta kararlÕdÕr. Rafinozun hidrolizini gerçekleútiren di÷er formu ise pH 5.1’de optimum gösterirken pH 3.7-5.5 aralÕ÷Õnda oldukça kararlÕdÕr (Nakagawa et al., 1971). Thermotoga maritima invertazÕnÕn optimum pH’sÕ rafinoz, inulin ve sükroz için pH 5.5 olarak bulunmuútur. pH 4.2-7.1 aralÕ÷Õnda ise 37 baúlangÕç aktivitesinin en az % 50’sinden fazlasÕnÕ göstermektedir (Liebl et al., 1998). Çeúitli invertazlarÕn optimum pH de÷erleri Çizelge 1.5’de verilmiútir. 1.1.5.4 ønvertaz aktivitesine çeúitli kimyasallar ve inhibitörlerin etkisi ønhibitörler enzimatik reaksiyonun hÕzÕnÕ azaltan maddelerdir. Enzimatik reaksiyonlarÕn inhibisyonu incelendi÷inde oldukça önemli bilgiler edinilebilmektedir. ønhibisyon yaratan maddelerin etki úeklinin belirlenmesi, söz konusu enzimlerin metabolizmadaki önemlerini aydÕnlatabilmek için inhibisyon çalÕúmalarÕna gerek duyulmaktadÕr. BazÕ durumlarda inhibitörlerin yararlarÕ da göz ardÕ edilemez bir gerçektir. Birçok enzim için spesifik inhibitörler üretilir ve bu inhibitörler kontaminasyona neden olan, ana enzim preparatÕndan ayrÕlmasÕ güç veya imkansÕz olan enzim aktivitelerinin ortadan kaldÕrÕlmasÕnda kullanÕlÕr (Telefoncu, 1986). ønvertazlarla yapÕlan inhibisyon çalÕúmalarÕnda kullanÕlan inhibitörler genel olarak üç sÕnÕf altÕnda toplanmÕútÕr. Bunlar; grup spesifik reaktifler, metal iyonlarÕ ve úekerler ile bu úekerlerin türevleridir. Grup spesifik reaktiflerden sülfidril reaktifleri (örne÷in; pkloromerküribenzoat, N-etil maleimid ve iyodoasetamid) en çok kullanÕlan inhibitörlerdir. ønhibitör olarak çok çeúitli metal iyonlarÕ da (örne÷in; Ag+, Cu+2, Hg+2, Mg+2, Ni+2, Ba+2 gibi) kullanÕlarak invertazlarÕn inhibisyonu incelenmiútir. Nicotiana glauca Zymomonas mobilis Thermotoga maritima Lactobacillus reuteri CRL1100 Pseudomonas fluorescens Glycine max Lilium auratum Ricinus communis Lycopersicon esculentum Beta vulgaris Bambusa eduli Saccharomyces cerevisiae Candida utilis ønvertaz Kayna÷Õ 38 Vakular invertaz øntraselüler invertaz S-Formu F-Formu Ekstraselüler invertaz øntraselüler invertaz Alkali invertaz øzoenzim IT I øzoenzim IT II ønvertaz ȕ-FFase-E ȕ -FFase L ønvertaz ønvertaz Alkali invertaz ønvertaz-1 ønvertaz-2 ønvertaz ønvertaz Sükroz Rafinoz ønulin Sükroz Sükroz Rafinoz ønulin Sükroz Sükroz Rafinoz Sükroz Sükroz Sükroz Sükroz Sükroz Sükroz Sükroz Sükroz 3.8 6.5 8.0 4.0 7.5 3.5 ve 5.5 3.6 5.1 6.0 6.5 7.0 4.0 5.4 5.5 4.5 4.4 Rojo et al., 1998 Ait-Abdelkader et al., 2000 Liebl et al., 1998 Gines et al., 2000 Bugbee, 1984 Chen and Black, 1992 Signh and Knox, 1985 Prado et al., 1985 Nakagawa et al., 1971 Masuda et al., 1987 Liu et al., 2006 Gascón et al., 1968 Belcarz et al., 2002 Substrat Optimum pH Referans Çizelge 1.5 BazÕ invertazlarÕn optimum pH de÷erleri Asit invertaz lbbetafruct2 lbbetafruct3 AIV I AIV II Ipomoea batatas Pyrus pyrifolia Sitoplazmik invertaz ønvertaz I ønvertaz II ønvertaz Nicotiana tabacum Bifidobacterium lactis Avena sativa ønvertaz Kayna÷Õ Sükroz Rafinoz Stakiyöz Sükroz Levan Raftiloz Sükroz Melibioz Rafinoz Trehaloz Sükroz Selobiyoz Maltoz Laktoz ønulin Rafinoz Stakiyöz Sükroz Stakiyöz Rafinoz Substrat 4.5 5.0 4.0 6.0 4.3 5.0 Optimum pH Çizelge 1.5 (devam) Hashizume et al., 2003 Wang et al., 2005 Nakamura et al., 1988 Janer et al., 2004 Pressey and Avants, 1980 Referans 39 40 Son grup olarak úekerler ve úeker türevleri de invertazlarÕn inhibisyon çalÕúmalarÕnda kullanÕlan önemli bir sÕnÕftÕr. ønvertazlarÕn en önemli, en güçlü ve kompetitif inhibitörü olan fruktozun yapÕsal analoglarÕ (2,5anhidro-D-mannoz, 2,5-dideoksi-2,5-imino-D-mannitol) da invertaz için inhibitör etkisi göstermektedir (ùekil 1.12) (Workman and Day, 1983, Legler et al., 1993). ùekil 1.12 Fruktozun yapÕsal analoglarÕ Metal iyonlarÕnÕn invertaz aktivitesi üzerine etkisinin incelendi÷i çalÕúmalarda metal iyonlarÕnÕn hangi tipte bir inhibisyon oluúturdu÷u belirlenmiútir. Örne÷in; Saccharomyces cerevisiae invertazÕ K2PtCl3 ile nonkompetitif olarak inhibe edilmektedir (Baseer and Shall, 1971). Lycopersicon esculentum (domates) invertazÕ Ag+ ve Cu+2 iyonlarÕ ve p-merküribenzoat (PCMB) ile önemli oranda bir inhibisyona u÷ramaktadÕr (Nakagawa et al., 1971). Phytophthora megasperma invertazÕ da 0.1 ve 1 mM Ag+ iyonu ile sÕrasÕyla aktivitesinin % 62 ve % 41 89’unu, 0.1 ve 1 mM Hg+2 iyonu ile de sÕrasÕyla aktivitesini % 44 ve % 96’sÕnÕ kaybederken, 0.1 mM p-merküribenzoat ile tamamen inhibe olmaktadÕr. Bu sonuçlar do÷rultusunda Phytophthora megasperma invertazÕnÕn yapÕsÕnda sülfidril grubu içerdi÷i ama bu sülfidril gruplarÕnÕn aktivite için zorunlu olmadÕ÷Õ belirtilmiútir (West et al., 1980). Bambusa edulis invertazÕnÕn IT I ve IT II izoformlarÕ Mg+2 ile etkilenmezken, Hg+2 ile çok yüksek bir oranda inhibe olmaktadÕrlar. IT I aktivitesinin 5 mM pirodoksin, 0.5 mM p-merküribenzoat ve 15.0 mM anilin ile sÕrasÕyla % 48, % 62 ve % 66’sÕnÕn inhibe edildi÷i belirlenmiú ve bunun aktif merkezinde sistein, asidik ve bazik aminoasitlerin varlÕ÷Õna iúaret etti÷i ifade edilmiútir. IT II aktivitesi ise 5 mM iyodoasetamid, 15.0 mM anilin, 0.5 mM fenilmetilsilfonil florid, 5 mM pirodoksin ve 0.5 mM pmerküribenzoat ile sÕrasÕyla % 44, % 48, % 60, % 75 ve % 86’sÕnÕn inhibe edildi÷i belirlenmiú ve bununda aktif merkezinde sistein, asidik ve bazik aminoasitler ile serin ve tirozinin varlÕ÷Õna iúaret etti÷i ifade edilmiútir (Liu et al., 2006). Tropaeolum majus invertazÕ úekerlerden fruktoz, glukoz, turanoz ve maltoz ile kuvvetlice inhibe olurken selobiyoz, galaktoz, laktoz, melezitoz, melibioz ve trehaloz ise çok zayÕf bir etki yaratmaktadÕr (Isla et al., 1988). Daucus carota nötral ve alkali invertazlarÕnÕn Hg+2 ile inhibe olmadÕ÷Õ belirlenmiú ve enzim aktif merkezinde sülfidril grubunun olmadÕ÷Õ sonucuna varÕlmÕútÕr. Daucus carota invertazÕnÕn her iki formu da fruktoz ile kompetitif tipte inhibe olurken, glukoz ile yaratÕlan inhibisyon tipinin ise nonkompetitif tip oldu÷u belirlenmiútir (Lee and Sturm, 1996). Çizelge 1.6, çeúitli kaynaklara ait invertazlarÕ kuvvetli bir úekilde inhibe eden inhibitörler ve bu inhibitörlerin enzim aktivitesine etkisi verilmiútir. reuteri CRL 1100 Lactobacillus megasperma Phytophthora Avena sativa ønvertaz Kayna÷Õ 42 0.002 0.004 PCMB I2 Cd+2 Cu 1 1 10 ȕ-merkapto etanol +2 10 34 10 5 0 0 4 1 0.1 56 11 38 0 79 45 0 Ba÷Õl Aktivite (%) 0.01 DTT PCMB Hg+2 1 0.01 0.002 Hg+2 Ag 0.02 Ag+ + ønhibitör Konsantrasyonu (mM) ønhibitör Çizelge 1.6 Çeúitli inhibitörlerin invertaz aktivitesine etkisi. 2000 Ginés et al., 1980 West et al., 1980 Pressey and Avants, Referans ochraceus Aspergillus Tropaeolum majus edulis (IT II) Bambusa ønvertaz Kayna÷Õ Hg NEM PCMB +2 Cu Fruktoz Glukoz Sükroz PCMB øyodoasetamid Turanoz Maltoz Selobiyoz Galaktoz Laktoz Melibioz Trehaloz Cd-asetat 1 10 10 1 2.5 2.5 1000 0.5 5 20 80 40 50 40 40 50 10 5 Ca+2 +2 ønhibitör Konsantrasyonu (mM) ønhibitör Çizelge 1.6 (devam) 0 0 10 15 30 28 62 14 56 0 60 78 90 83 87 77 50 16 Ba÷Õl Aktivite (%) 2001 Ghosh et al., Isla et al., 1998 2006 Liu et al., Referans 43 44 1.1.6 ønvertazlarÕn fizyolojik önemi ve uygulama alanlarÕ Bitkilerin en önemli özelliklerinden bir tanesi karbondioksidi, güneú ÕúÕ÷Õ ve su varlÕ÷Õnda karbohidratlara indirgemesi ve özümlenen karbonun bitkinin fotosentetik olmayan dokularÕna (kök, yumru, tohum gibi) taúÕnmasÕdÕr. Pek çok bitkide taúÕnan karbohidrat sükrozdur. Fizyolojik aktivite ve heterotrofik dokularÕn biyokimyasal ihtiyaçlarÕna göre sükroz sinyal molekül olarak çeúitli yollar boyunca heterotrofik dokulara yöneltilir. Enerji ihtiyacÕ için glikoliz veya sitrat çevrimine girerek ATP ve NADH üretilmesini sa÷lar veya hücre büyümesi ve geliúmesi için gerekli olan primer metabolitlerin biyosentezi için karbon kayna÷Õ olarak kullanÕlÕr. Sükroz, uzun süreli depo amacÕyla niúasta, triaçilgliseridler veya polipeptitler gibi polimerlere veya bitkinin, biotik ve abiyotik stres faktörlerine karúÕ mücadele edebilmesi için sekonder metabolitlere dönüútürülür. Sükroz ayrÕca çiçekli bitkilerin % 15’inde bulunan fruktoz polimerleri olan fruktanlarÕn sentezinde baúlangÕç moleküldür. Bitkiler bu iúlemleri gerçekleútirebilmek için etkili ve kesin kontrol mekanizmalarÕna ihtiyaç duymaktadÕr (Sturm, 1999). Bu sebeple sükrozu karbon ve enerji kayna÷Õ olarak kullanabilmek için Į1-ȕ2glikozidik ba÷Õn yÕkÕlmasÕ gerekmektedir. Bu reaksiyon ise bitkilerde iki farklÕ enzim tarafÕndan katalizlenmektedir; invertaz (EC 3.2.1.26) ve sükroz sentaz (EC 2.4.1.13). ønvertaz geri dönüúümü olmayan katalitik bir reaksiyonla sükrozu glukoz ve fruktoza dönüútürür. Sükroz sentaz ise geri dönüúümlü bir reaksiyon ile ba÷ enerjisini koruyarak glikozil artÕ÷ÕnÕ uridin difosfata (UDP) transfer ederek sükrozu UDP-glukoz ve fruktoza dönüútürür (Roitsch and González, 2004). ønvertazlar tercihan sükrozu hidrolizler fakat ayni zamanda 1-kestoz, rafinoz ve stakiyöz gibi donör substratlarÕn degradasyonunu da katalizler. ønulin veya levan gibi uzun fruktanlara karúÕ ilgisi düúük olmasÕna ra÷men invertazlarÕn aktivite 45 gösterdi÷i belirtilmiútir. ønvertazlar bitkilerde karbohidrat transportu ve katalizi, stres cevabÕ gibi hücresel proseslerde ve hücre farklÕlaúmasÕ ile bitkinin büyümesinde hayati bir rol oynamaktadÕr. ønvertazlarÕn gen ekspresyon seviyeleri ise patojen enfeksiyonu ve yaralanmalara karúÕ ayarlanmaktadÕr (Lammens, W. et al., 2007). Glikozidazlar, hem hidrolitik aktiviteleri nedeniyle glikozidik ba÷larÕn hidrolizinde kullanÕlabilirler hem de transglikozilasyon aktiviteleri nedeniyle karbohidrat yapÕlarÕnÕ çeúitli bileúiklerin hidroksil gruplarÕna transfer edebilirler. GlikozidazlarÕn bu transglikolizasyon aktivitesi çeúitli oligosakkaritlerin enzimatik sentezinde kullanÕlabilir (Yanahira et al., 1998). ønvertazlar ortamdaki sükroz konsantrasyonu % 10 (w/v)’dan düúük oldu÷u durumda sükrozu, glukoz ve fruktoza hidrolizler. Ancak bazÕ invertazlar ortamdaki sükroz konsantrasyonu % 10 (w/v)’dan yüksek oldu÷unda transfruktozilleme aktivitesi göstererek fruktooligosakkaritlerin (FOS) sentezini katalizlemektedir. Bitkilerden ve mikroorganizmalardan elde edilen ȕ-D-fruktoziltransferaz enzimi de (FTase, EC 2.4.1.9) ayni aktiviteye sahiptir (Rubio et al., 2002). Fruktooligosakkaritler (FOS), fruktozil birimlerinin sükroz molekülünün ȕ-2,1-pozisyonuna ba÷lanmasÕyla oluúurlar. Fruktooligosakkaritler genellikle; (1F(1-ȕ-D-fruktofrunazidaz)n-1 sükroz; GFn, n=2-4) nistoz (GF3) ve 1Ffruktofuranozil nistozdan (GF4) oluúan fruktooligomerlerdir (L’Hocine et al., 2000). AyrÕca fruktooligosakkaritler, inulin polimerinin enzimatik veya kimyasal yolla degradasyonu ile de üretilirler. Neo-úekerler olarak da adlandÕrÕlan fruktooligosakkaritlerin üretimi, mükemmel biyolojik ve iúlevsel özelliklere sahip olmasÕ, intestinal mikrofloranÕn geliútirilmesi, konstipasyon (kabÕzlÕk) sorununu azaltmasÕ, serumdaki total kolesterol ve lipidleri düúürmesi, hayvanlarÕn büyümesini sa÷lamasÕ ve düúük kalorili karsinojen olmayan tatlandÕrÕcÕlar olarak kullanÕlmasÕndan, dolayÕ son molekülleridir. Örne÷in; 1-kestoz (GF2), 46 yÕllarda dikkat çekici bir alan olmuútur (Nguyen et al., 2004). Bu kadar önemli özelli÷inden dolayÕ, pek çok bilim insanÕ FOS üretimi için dünya çapÕnda yeni teknolojilerin geliútirilmesini araútÕrmaktadÕr: geliúmiú daha iyi prebiyotik ve fizyolojik özelliklere sahip yeni fruktooligosakkaritlerin ve FOS sentezleyen yeni enzimlerin keúfedilmesi gibi. Aspergillus sp 27H’dan izole edilen invertazÕn reaksiyon koúullarÕnÕn modifiye edilmesi ile hem hidrolitik hem de transfruktozilasyon aktivitesi gösterdi÷i belirtilmiútir. Düúük sükroz konsantrasyonunda (10 g/dm3) sükrozu, glukoz ve fruktoza hidrolizlerken, yüksek sükroz konsantrasyonunda (216 g/dm3) transfruktozil aktivitesinin arttÕ÷Õ gözlenmiútir. pH’Õn 5.5, sÕcaklÕ÷Õn 40 C, sükroz konsantrasyonunun 615 g/dm3 ve enzim konsantrasyonunun 20 ȕ-fructofuranozidaz birimi/g sükroz oldu÷u koúullar altÕnda fruktooligosakkarit miktarÕ maksimum de÷eri olan 376 g/dm3 (234 g/dm3 o kistoz ve 142 g/dm3 nistoz) ulaúmaktadÕr. Bu de÷erlere göre Aspergillus sp 27H’dan izole edilen invertazÕn FOS sentezinde ticari olarak kullanÕlabilece÷i belirtilmektedir (Fernández et al., 2004). Schwanniomyces occidentalis invertazÕ transfruktozil aktivitesine sahip bir baúka ȕ-fruktofuranozidaz olup transfruktozilleme reaksiyonu sonucu iki tane fruktooligosakkarit (FOS) üretti÷i belirtilmiútir (ùekil 1.13). 1H, 13C ve 2D-NMR teknikleri sonucunda en fazla üretti÷i ürününün prebiyotik trisakkarit olan 6-kestoz oldu÷u bulunmuútur. Bu invertazÕn 6-kestoz üretim veriminin, bugüne kadar belirtilen di÷er 6kestoz üreten enzimlerin verimlerinden daha fazla oldu÷u tespit edilmiútir (Benito et al., 2007). 47 ùekil 1.13 Schwanniomyces occidentalis invertazÕnÕn transfruktozilleme reaksiyonu Arthrobacter globiformis’den saflaútÕrÕlan invertazÕn transfruktozilleme reaksiyonuyla, sükroz donör, selobiyoz veya selotrioz ise akseptör olarak kullanÕlarak, iki tane yeni indirgen olmayan oligosakkarit sentezlenmiútir (ùekil 1.14). YapÕlan spektrometrik analizler sonucunda O-ȕ-D-glukopiranozil-(1ĺ4)-Į-D-glukopiranozil(1ĺ2)-Į,ȕ-D-fruktofuranozid ve O-ȕ-D-glukopiranozil(1ĺ4)-ȕ-Dglukopiranozil-(1ĺ4)-Į-D-glukopiranozil-(1ĺ2)-Į, ȕ-D-fruktofuranozid olarak tanÕmlanmÕútÕr. Her iki oligosakkaritin 100oC’de 30 dk boyunca kararlÕ oldu÷u ve pH 2’de degradasyona u÷ramadÕ÷Õ belirtilmiútir. Bu özellikleri nedeniyle bu oligosakkaritlerin, gÕda ve farmasötik alanda meydana gelen Maillard reaksiyonlarÕnÕ engellemek için kullanÕlabilece÷i belirtilmiútir (Win et al., 2004). 48 ùekil 1.14 Arthrobacter globiformis invertazÕnÕn transfruktozilleme reaksiyonu ønvertazlar, endüstriyel alanda özellikle gÕda sanayinde pek çok uygulama alanÕ bulmuú enzimlerdir. ùeker endüstrisinde invertazlar, bir disakkarit olan sukrozu glukoz ve fruktoza hidrolize eder. Sukroz polarize ÕúÕk düzlemini sa÷a (+66.5, dekstrorotatori), hidroliz sonucu meydana gelen úeker karÕúÕmÕ ise polarize ÕúÕk düzlemini sola (-33.3, levorotatori) çevirir. Bu nedenle, bu iúlem inversiyon, hidroliz ürünü de invert úeker olarak adlandÕrÕlÕr. Sukrozun tatlÕlÕk derecesi 100 olarak kabul edildi÷inde, invert úekeri oluúturan glukoz ve fruktozun tatlÕlÕk dereceleri sÕrasÕyla 70 ve 180’dir. Bu nedenle invert úeker eúde÷er miktardaki sukrozdan daha fazla tatlÕlÕk sa÷lar ve úekerli ürünlerin 49 hazÕrlanmasÕnda yaygÕn olarak kullanÕlÕr. ønvert úekerin di÷er bir kullanÕm amacÕ da kristalizasyon kontrolüdür. Sukrozun hidrolizi sonucu oluúan invert úekerdeki glukoz ve fruktozun sudaki toplam çözünürlükleri sukrozun tek baúÕna çözünürlü÷ünden daha fazladÕr. Kristalizasyonun azalmasÕnda sukroz konsantrasyonun azalmasÕ da etkilidir. Bu sebeple úekerli ürünlerde invert úeker içeri÷i çok önemlidir. Örne÷in; lokumda invert úeker içeri÷inin fazla olmasÕ lokum dilimlerinin birbirine yapÕúmasÕna ve depolama sorunlarÕna, yetersiz olmasÕ ise kristallenmeye ve pürüzlü yapÕya neden olmaktadÕr. ønversiyon çikolata kaplÕ sÕvÕ veya krem dolgulu úekerlemelerin üretiminde de kullanÕlmaktadÕr. KalÕplama ve kaplama iúlemleri dolgu kÕsÕm katÕ iken yapÕlÕr. Daha sonra dolguya verilen invertaz enzimi sukrozu invert úekere dönüútürür ve çözünürlükteki de÷iúimle dolguda yumuúama veya sÕvÕlaúma görülür. ùeker endüstrisinde, kamÕú melasÕnÕn etanole fermantasyonu, sÕ÷Õr yemlerinin ve invert úeker úuruplarÕnÕn hazÕrlanmasÕ, likör, yapay bal ve dondurulmuú tatlÕ ve benzeri üretimlerin yapÕlmasÕnda kullanÕlan biyoteknolojik proseslerde invertaz enzimleri kullanÕlmaktadÕr (SaldamlÕ, 2005). Biyoteknolojik uygulama alanlarÕ nedeniyle invertazlar oldukça önemli ve de÷erli bir enzim grubudur. 50 2. SULU øKøLø FAZ SøSTEMø (ATPS) Rekombinant proteinlerin ve enzimlerin üretimi için makul fiyata yeterli saflaútÕrmayÕ gerçekleútiren teknolojilerin geliúmesine ihtiyaç duyulmaktadÕr. Bu sebeple bilim insanlarÕ daha ekonomik protein saflaútÕrma teknikleri geliútirmek için u÷raúmaktadÕrlar. Son elli yÕlda, araútÕrmacÕlar protein geri kazanÕmÕ ve saflaútÕrÕlmasÕ için sÕvÕ-sÕvÕ ekstraksiyon sistemlerine ilgi duymaktadÕrlar. Normalde sÕvÕ-sÕvÕ ekstraksiyonu organik çözgenlerin kullanÕmÕnÕ içermektedir. Ancak proteinler organik çözgenlerde çözünememekte ve denaturasyona u÷ramaktadÕr. SÕvÕ-sÕvÕ ikili faz sistemleri iki polimer veya polimer / tuz çözeltileri kullanÕlarak da oluúturulabilmektedir. Bu olgu ilk kez 1896 yÕlÕnda Beijerinck tarafÕndan agar ve niúasta veya jelatinin karÕútÕrÕlmasÕyla oluúan ikili fazÕ gözlemlemesi ile tanÕmlamÕútÕr. Bu ikili sistemler, sulu ikili faz sistemi olarak isimlendirilmiú ve ilk kez 1956 yÕlÕnda Albertsson tarafÕndan biyomoleküllerin geri kazanÕmÕnda uygulanmÕútÕr. Albertsson bu çalÕúmalarÕ ile mikroorganizmalarÕn, hücre duvarlarÕnÕn, kloroplast ve di÷er biyolojik moleküllerin fazlar arasÕnda seçimli olarak da÷ÕldÕ÷ÕnÕ ortaya koymuútur. Daha sonraki çalÕúmalarÕnda ise farklÕ polimerlerin konsantrasyonlarÕnÕn ve molekül a÷ÕrlÕklarÕnÕn etkilerini inceleyerek birkaç farklÕ sistemin faz diyagramlarÕnÕ oluúturmuútur. Chlorella ve Aerobacter türlerinin hücre duvarlarÕnÕn izolasyonunu bu sistemleri kullanarak gerçekleútirmiútir (Balasubramaniam, 2003). Sulu ikili faz sistemleri (Aqueous Two Phase Systems: ATPS) biyolojik moleküllerin (örne÷in; protein, hücre, organel ve biyolojik membranlar) ekstraksiyonu ve saflaútÕrÕlmasÕnda kullanÕlan seçimli ve etkin bir metoddur. Genellikle yapÕsal olarak farklÕ ve hidrofilik 51 polimerlerin (polietilen glikol (PEG) ve dekstran) ya da bir polimer ile inorganik tuzun (sülfat, fosfat, sitrat vb.) oluúturdu÷u polimer-polimer veya polimer-tuz sistemleridir. Bu komponentlerin kritik konsantrasyonlarÕ üzerinde kendili÷inden ikili faz oluúur. Polimerpolimer sisteminde her bir faz kendisini oluúturan polimerce zengindir. Polimer-tuz sisteminde ise fazlardan bir tanesi sistemi oluúturan polimerce, di÷er faz ise tuzca zengindir. PEG / Dekstran sistemleri küçük ölçekte makromoleküllerin, membranlarÕn, hücre partiküllerinin ya da hücrelerin ayrÕlmasÕnda kullanÕlÕrken PEG / Tuz sistemleri daha çok büyük ölçekteki ekstraksiyonlarda kullanÕlÕrlar. PEG / Tuz sistemleri, PEG / Dekstran sistemlerine göre daha düúük viskozite ve maliyete sahip olduklarÕndan daha avantajlÕdÕrlar. Her iki sistemde biyouyumludur ve % 70–90 gibi oldukça yüksek su içeri÷inden dolayÕ biyomoleküller için toksik olmayan ÕlÕmlÕ bir çevre oluúturmaktadÕr. AyrÕca polimerlerin protein ve enzim aktivitesi ve yapÕsÕna stabilize edici etkileri vardÕr. Sulu ikili faz sistemlerinin bilinen ayÕrma ve saflaútÕrma tekniklerine (kromatografi, filtrasyon, santrifüjleme ve elektroforez) göre bazÕ avantajlarÕ vardÕr. Sulu ikili faz ayÕrma tekni÷i özellikle tek adÕmda saflaútÕrma için uygundur. Bir adÕmdan oluúan bir iúlemle istenilen proteinin deriútirilmesi ve saflaútÕrmasÕnÕ gerçekleútirebilmektedir. Sulu ikili faz sisteminin bir baúka üstünlü÷ü ise ölçek büyütmenin kolayca mümkün olmasÕdÕr. Yöntemin di÷er avantajlarÕ ise; ara yüzey geriliminin düúük olmasÕ nedeniyle biyomoleküllerin degradasyonunu minimize etmesi, proses zamanÕ ve enerji tüketiminin düúük olmasÕ, yüksek rezolusyon ve verimlilikte ayÕrÕmÕn gerçekleútiriliebilmesi ve maliyetin düúük olmasÕ olarak sÕralanabilir (Yue et al., 2007; Negrete et al., 2007). Faz sisteminin ve moleküllerin genel karakteristik özellikleri ve ortamdaki etkileúimlerine ba÷lÕ olarak moleküller iki faz arasÕnda seçimli olarak da÷ÕlÕrlar. Fazlar arasÕnda küçük moleküller tarafsÕzca da÷ÕlÕrken, 52 makromoleküllerin da÷ÕlÕmÕ de÷iúkendir. Pek çok bilim adamÕ proteinlerin neye göre da÷ÕldÕ÷ÕnÕ modelleme yapmaya çalÕúmÕúsa da bu çok güçtür. Bu sebeple yol gösterecek geniú kapsamlÕ bir teori veya kuram yoktur. Biyomoleküllerin fazlara da÷ÕlÕmÕnÕ açÕklamak için genellikle sistematik araútÕrma yapmak gerekmektedir. Da÷ÕlÕmÕ etkileyen faktörlerin belirlenmesi ve bu faktörlerden lehte olanlarla bir veya daha fazla set varyasyonlar oluúturularak en iyi ayrÕmÕ veren koúul elde edilmeye çalÕúÕlmaktadÕr. Sulu ikili faz sistemi iki adÕmdan oluúan bir iúlemdir. ølk adÕm dengeleme ve son adÕmda faz ayrÕmÕnÕn gerçekleúmesidir. Dengeleme; sistemi oluúturan komponentlerin (protein ekstraktÕ, polimer ve tuz) ilave edilmesi ve karÕútÕrÕlmasÕ ile iki fazÕn kendili÷inden dengeye gelmesi için dispersiyonunu içerir. Dengeleme adÕmÕ ço÷u zaman hÕzlÕ bir prosestir (25oC ’de 2–3 dk hafif vorteksleme ve 15 dk bekletme). Faz ayrÕmÕ adÕmÕ ise, iki faz arasÕndaki ayrÕmÕn belirgin olma aúamasÕdÕr. Fazlar arasÕndaki yo÷unluk ve viskoziteleri arasÕndaki küçük farklanmalardan dolayÕ birkaç dakikadan birkaç saate kadar de÷iúen aralÕklarda santrifüj iúleminin yer aldÕ÷Õ operasyon basama÷ÕdÕr (4000 rpm *10 dk). 2.1 Faz DiyagramlarÕ Faz diyagramlarÕ, sulu ikili faz sistemleri için muhtemel çalÕúma alanlarÕnÕ ifade etmektedir. Bu nedenle faz diyagramlarÕ belirtilen sÕcaklÕk, pH ve tuz konsantrasyonu gibi koúullar altÕnda her bir sulu ikili faz sisteminin oluúmasÕ için ayÕrÕcÕ bir özelliktedir (ùekil 2.1). Faz diyagramlarÕ, sulu ikili faz sistemi oluúturmak için gerekli olan faz oluúturucu komponentlerin (PEG ve tuz gibi) konsantrasyonlarÕ, alt ve 53 üst fazlardaki di÷er faz komponentlerinin konsantrasyonu ve faz hacimlerinin oranlarÕ hakkÕnda bilgi edinmeyi sa÷lar. ùekil 2.1 Faz diyagramÕ Faz diyagramÕ binodiyal e÷ri ve “tie-line” diye adlandÕrÕlan özel ba÷lantÕlÕ hatlar içermektedir. Binodiyal e÷ri, faz diyagram bölgesini ikiye bölmektedir. E÷rinin üstündeki bölgede birbiri içerisinde karÕúmaz iki sulu fazÕn meydana geldi÷ini, e÷ride ve e÷rinin altÕndaki bölgede ise tek fazÕn oluútu÷unu belirtmektedir. OlmasÕ muhtemel tüm sulu ikili faz sistemleri binodiyal e÷ri üzerinde birbiri ile ba÷lantÕlÕ iki nod arasÕnda çizilen ve “tie-line” olarak adlandÕrÕlan hatlar üzerinde koordinatlandÕrÕlmÕútÕr. Tie-line hatlarÕ, alt ve üst fazdaki kompononentlerin olmasÕ gereken en son konsantrasyonlarÕnÕ göstermektedir (T ve B). Ayni tie-line hatlarÕnÕn koordinatlarÕ üzerinde 54 gidildi÷inde alt ve üst fazdaki kompononentlerin son konsantrasyonlarÕ de÷iúmezken, sistemlerin total kompozisyonlarÕ ve faz hacimleri farklanÕr (A1, A2 ve A3). Binodiyal e÷ri ve üzerinde her iki fazÕn total kompozisyonu ile hacimlerinin eúit oldu÷u noktalara “kritik nokta (Cp)” denilmektedir. Kritik nokta tie-line hattÕnÕn orta noktalarÕnÕn ekstrapole edilmesi ile belirlenmektedir (Hatti-Kaul, 2000). 2.1.1 Binodiyal e÷ri Sulu ikili faz teknolojisinde hazÕrlÕk aúamalarÕnda kullanÕlmak üzere binodiyal e÷ri oluúturmak için sistem parametrelerinin seçilmesi gerekir. Ancak PEG / Dekstran ve PEG / Tuz sistemleri için de÷iúen PEG molekül kütlelerinde faz diyagramlarÕ yayÕnlanmÕútÕr. Bu metodlardan bir tanesi ile polimer / polimer veya polimer / tuz sistemleri için binodiyal e÷ri geliútirilebilmektedir. Binodiyal e÷ri oluúturmak için iki metot; turbidometrik titrasyon metodu (1) ve “cloud-point metodu” (2) mevcuttur (ùekil 2.2). Turbidometrik titrasyon metodu (1) en hÕzlÕ ve yaygÕn olan metottur. Bu metot ile bilinen total kompozisyon ve kütledeki faz komponentleri karÕútÕrÕlarak hazÕrlanan bulanÕk sistem serileri, su veya di÷er çözgenler ile karÕúÕm açÕk ve tek bir faz oluúuncaya kadar seyreltilir. BulanÕklÕktan berraklÕ÷a geçiú olan noktada faz kompozisyonu hesaplanÕr ve e÷ride iúaretlenir. Cloud-point metodu (2) da ayni prensibe dayanmaktadÕr. Konsantrasyonu bilinen polimer çözeltisi bir test tüpüne konulur. Daha sonra konsantrasyonu bilinen ikinci bir polimer ya da tuz çözeltisi test tüpüne damla damla ilave edilir ve karÕútÕrÕlÕr. 55 ùekil 2.2 Turbidometrik titrasyon ve “cloud-point” metotlarÕ ølk baúlarda karÕúÕm berraktÕr ancak ilave edilen ikinci çözeltinin belirli bir de÷erin üzerine çÕkmaya baúlandÕ÷Õ kritik noktadan (cloud-point) itibaren karÕúÕm bulanÕklaúmaya ve iki faza ayrÕlmaya baúlar. Bu karÕúÕmÕn kütlesi hesaplanÕr ve oluúan ikili fazÕn kompozisyonu hesaplanÕr ve e÷ride iúaretlenir. Bu karÕúÕm tekrar seyreltilir ve prosedür tekrarlanÕr. Bu metodlar Dekstran / metilselüloz sistemi gibi polidispers polimerler ile çalÕúÕldÕ÷Õnda hatalÕ sonuçlar vermektedir (Hatti-Kaul, 2000). 56 2.1.2 Tie-line hatlarÕ Tie-line hatlarÕnÕn uzunluklarÕnÕn birimi komponentlerin konsantrasyonlarÕ gibi % w/w ile ifade edilir. Tie-line hatlarÕnÕn uzunlu÷u ve fazlarÕn kütlesi aúa÷Õdaki denklem ile ba÷lantÕlÕdÕr; Vüst ȡüst / Valt ȡalt= DF / ED “V” ve “ȡ” ifadeleri üst ve alt fazlarÕn sÕrasÕyla hacim ve yo÷unluklarÕnÕ ve DF ile DE ise gösterilen tie-line hatlarÕnÕn uzunluklarÕnÕ ifade etmektedir (ùekil 2.3). Tie-line hatlarÕ genellikle paraleldir bu sebeple tie-line hattÕnÕn e÷imi di÷erlerinin çizilmesinde kullanÕlmaktadÕr. Faz kompozisyonlarÕ analizi ve her bir fazdaki polimer ve tuz konsantrasyonlarÕnÕn belirlenmesi boyut dÕúlamalÕ kromatografi, gravimetrik analiz, refraktif indeks ölçümü, optik rotasyon ve iletkenlik ölçümleri ile kullanÕlarak yapÕlmaktadÕr. ùekil 2.3 Tie-line hatlarÕ 57 Faz diyagramlarÕ ayrÕca istenilen seviyede saflaútÕrma yapabilmek için optimum sistem kompozisyonlarÕnÕn belirlenmesini sa÷lamaktadÕr. Protein saflaútÕrmak için en uygun sulu ikili faz sistemini seçmek için hedeflenen proteinin selektivitesinin di÷er proteinlerden yüksek olmasÕ gerekmektedir. Selektivite (Į) aúa÷Õdaki formulle; Į =KP / KC ifade edilmektedir. KP, hedeflenen proteinin da÷ÕlÕm katsayÕsÕ iken KC di÷er proteinlerin da÷ÕlÕm katsayÕsÕdÕr. Ayni tie-line hattÕ üzerinde proteinlerin da÷ÕlÕm katsayÕlarÕ ayni kaldÕ÷Õndan istenilen proteinin seçimlili÷i de belirli bir tie-line hattÕ üzerinde iken tüm faz kompozisyonlarÕnda sabittir. Sabit bir seçimlili÷iin önemi saflaútÕrÕlmasÕ hedeflenen proteinin saflaútÕrma faktörünün faz oranlarÕnÕn çeúitlendirilmesi ile iyileútirilmesini sa÷lamasÕdÕr. Faz oranÕ; Faz OranÕ = Üst Faz Kütlesi / Alt Faz Kütlesi = DF / ED úeklinde ifade edilmektedir. Düúük faz oranÕ yüksek saflaútÕrma faktörü demektir. ED uzunlu÷undaki yükselme faz oranÕnÕ düúürmektedir. Faz oranÕnÕn azalmasÕyla istenilen proteinin verimi de düúmektedir. Bu nedenle, verim ve saflaútÕrma faktörü arasÕndaki dengeyi sa÷layan optimum faz oranÕ seçilmelidir (Balasubramaniam, 2003). 2.2 Da÷Õlma KatsayÕsÕ (K) Sulu ikili faz sisteminde moleküllerin fazlar arasÕndaki da÷ÕlÕmÕ da÷Õlma katsayÕsÕ (K) ile: 58 K= Cüst / Calt úeklinde karakterize edilir. Cüst ve Calt sÕrasÕyla üst ve alt fazdaki protein konsantrasyonlarÕnÕ simgelemektedir. Da÷Õlma katsayÕsÕ fazlarÕn, materyallerin ve sÕcaklÕ÷Õn özelliklerinin bir fonksiyonudur. Çözünen konsantrasyonundan ve fazlarÕn hacim oranlarÕndan ba÷ÕmsÕzdÕr. Proteinin da÷ÕlÕm katsayÕsÕ belli bir tie-line hattÕndaki tüm sistemler için sabittir. Da÷Õlma iúlemi pek çok faktör tarafÕndan etkilenmektedir. Uygun bir da÷Õlma katsayÕsÕnÕ sa÷lamak için bu faktörlerin deneysel çalÕúma ile optimize edilmesi gerekmektedir. Da÷Õlma katsayÕsÕ ve onu etkileyen faktörler aúa÷Õdaki gibi birkaç terim ile birlikte logaritmik olarak ifade edilebilmektedir: ln K = ln Ko + ln Kelec + ln Khfob + ln Kbiosp + ln Kbüy + ln Kkonf + …. Burada Kelec; proteinin net yükü, pH; iyon da÷ÕlÕmÕ ve polimerin yükü tarafÕndan belirlenen elektrostatik etkileri, Khfob; hidrofobikli÷i, Kbiosp; sistemin içinde bulunan ligandla olan afiniteye dayalÕ etkileúimleri, Kbüy; protein ve polimerin büyüklü÷ünü, Kkonf; konformasyonal etkileri ve Ko ise hesaba katÕlmayan di÷er faktörleri simgelemektedir. FarklÕ faktörler her ne kadar da birbirlerinden bir nebze ba÷ÕmsÕz olsalar da, büyük bir ihtimalle tamamen ba÷ÕmsÕz de÷ildirler. Örne÷in; faz oluúturan polimerlerden birinde hidrofobik grubun ortaya çÕkmasÕ, iyonlarÕn da÷ÕlÕmÕ ile elektrik potansiyelini biraz da olsa etkileyecektir (Hatti-Kaul, 2000). 59 2.3 Da÷Õlma MekanizmasÕ Da÷ÕlmayÕ kontrol eden mekanizma genellikle bilinmemektedir. Fazda yer alan partikül kendisini çevreleyen moleküllerle hidrojen ba÷Õ, hidrofobik ve elektrostatik etkileúimler ve van der Waals gibi zayÕf güçler oluúturarak etkileúim halindedir. Bu etkileúimlerin katkÕlarÕnÕ tahmin etmek oldukça zordur ancak muhtemelen net etkileri iki fazda farklÕ olmaktadÕr. Dengedeki bir sistemde, bir partikülün bir fazdan di÷er faza hareketi için gerekli olan enerji (ǻE) ile da÷Õlma katsayÕsÕ arasÕndaki iliúki; C1 / C2 = eǻE/kT olarak ifade edilir. C1 ve C2 sÕrasÕyla faz 1 ve faz 2 deki partiküllerin konsantrasyonlarÕdÕr, “k” Boltzman sabiti ve “T” ise mutlak sÕcaklÕktÕr. AçÕkça görülüyor ki, ǻE da÷Õlan partikülün büyüklü÷üne ba÷lÕ olmaktadÕr. Yani ne kadar büyük olursa kendisini çevreleyen fazla birlikte o kadar fazla atomla iliúkiye girecektir. Brønsted da÷Õlma ile ilgili olarak aúa÷Õdaki eúitli÷i; C1 / C2 = eȜM/kT önermektedir. M moleküler a÷ÕrlÕk ve Ȝ ise moleküler a÷ÕrlÕk dÕúÕndaki özelliklere ba÷lÕ faktördür. Küresel bir partikül için ise eúitlikte M yerine partikülün yüzeysel alanÕ (A) ifade eden eúitli÷in; C1 / C2 = eȜA/kT 60 dikkate alÕnmasÕnÕ gerekti÷ini belirtmektedir. Bu durumda Ȝ yüzeysel alan dÕúÕndaki özelliklere ba÷lÕ faktörü göstermektedir. Yüzeysel özellikler yüzey gerilim, birim alandaki yüzey serbest enerjisi ile ifade edilmelidir. Bundan dolayÕ hem büyüklük hem de yüzey alanÕ özellikleri da÷ÕlmayÕ belirlemede büyük öneme sahiptirler. Ayni zamanda partikülün net yüküde (Z) da÷ÕlmayÕ etkilemektedir. E÷er ki fazlar arasÕnda U1-U2 úeklinde bir elektrik potansiyel farkÕ bulunuyorsa eúitlikte Z (U1-U2) enerji terimi de olmalÕdÕr; C1 / C2 = exp ((ȜA + Z (U1-U2)) / kT) Eúitlikte Ȝ büyüklük ve net yük dÕúÕndaki faktörleri göstermektedir. Böylelikle, da÷ÕlmayÕ etkileyen toplam etki büyüklük, hidrofobisite, yüzeyin yükü ve partikülün ya da makromolekülün konformasyonu gibi faktörlere bölünmektedir (Albertsson, 1986). 2.4 Protein Da÷ÕlÕmÕnÕ Etkileyen Parametreler Proteinler, hücrelerin en geniú fraksiyonunu oluúturmaktadÕr. Proteinler, katalitik aktiviteye sahip enzimler, yapÕsal komponentler veya hücre içi ve/veya dÕúÕna spesifik sinyal veya madde taúÕnmasÕndan sorumlu taúÕyÕcÕlar gibi çok yönlü özelli÷e sahip biyomoleküllerdir. Proteinlerin fizikokimyasal özellikleri çok iyi bilinmektedir ve nükleik asit, polisakkarit veya lipitlere göre daha kolay karakterize ve izole edilebilmektedir. 61 Faz sisteminin ve moleküllerin genel karakteristik özelliklerine ve ortamdaki etkileúimlerine ba÷lÕ olarak moleküller iki faz arasÕnda seçimli olarak da÷ÕlÕrlar. Sistem komponentlerinin tipi, polimerin molekül a÷ÕrlÕ÷Õ, pH, sistemde bulunan iyonlarÕn türü ve konsantrasyonu gibi proteinlerin da÷ÕlmasÕnÕ etkileyen faktörler hakkÕnda çok geniú bilgi mevcuttur. Proteinin kendi da÷ÕlÕmÕnÕ etkileyen özellikleri ise; hidrofilik/hidrofobiklik karakteri ile yüküne etkiyen molekül kütlesi ve yüzeyinde yer alan amino asit artÕklarÕdÕr. Ancak farklÕ sistemlerde, tüm bu yüzey özelliklerinin proteinin da÷ÕlÕmÕna ne gibi katkÕda bulunaca÷Õna dair çok az úey bilinmektedir (Berggren et al., 1999). Sulu ikili faz sistemlerinde proteinlerin da÷ÕlmasÕnda sÕcaklÕk, pH, tuz türü ve konsantrasyonu, polimer türü ve molekül a÷ÕrlÕ÷Õ gibi parametreler de etkilidir. PEG / Tuz sistemlerinde biyomoleküllerin da÷ÕlÕmÕnÕ etkileyen temel mekanizma úematik olarak ùekil 2.4’de gösterilmiútir. PEG / Tuz sistemlerinde biyomoleküllerin da÷ÕlÕmÕ üst fazdaki polimerin “hacimsel dÕúlama etkisi” ile alt fazÕ oluúturan tuz fazÕnÕn “salting-out” etkisine ba÷lÕdÕr (ùekil 2.4a). Üst fazda polimer tarafÕndan iúgal edilen hacim polimerin deriúiminin artmasÕ ile artmaktadÕr (ùekil 2.4b). Ancak polimerin zincir uzunlu÷u veya molekül kütlesinin artmasÕ ile üst fazda biyomoleküller için yeterince yer kalmayaca÷Õndan biyomoleküller alt faza do÷ru da÷Õlma e÷iliminde olacaklardÕr (ùekil 2.4c). Bu etki “hacimsel dÕúlama etkisi” olarak adlandÕrÕlmaktadÕr. Alt fazda biyomoleküllerin çözünebilirli÷i tuz konsantrasyonun artmasÕ ile azalmaktadÕr. Bunun sonucunda biyomoleküllerin da÷ÕlÕmÕ üst faza do÷ru olmaktadÕr ve bu etki “salting-out etkisi” olarak adlandÕrÕlÕr (ùekil 2.4d). Yüksek polimer konsantrasyonu ve molekül kütlesi ile yüksek tuz konsantrasyonu içeren sulu ikili faz sisteminde ise biyomoleküllerin 62 da÷ÕlÕmÕ fazlarÕn ayrÕldÕ÷Õ kesitte birikimi ile sonuçlanÕr (ùekil 2.4e) (Babu et al., 2007). ùekil 2.4 PEG / Tuz sistemlerinde biyomoleküllerin da÷ÕlmasÕ 2.4.1 Polimer konsantrasyonu ve molekül kütlesinin etkisi Polietilen glikol (PEG) ve dekstran ikili faz sistemlerinde en çok kullanÕlan polimerlerdir. Her iki polimerde toksik etki göstermez ve bu nedenle gÕda ve farmasötik uygulamalarda kullanÕlmaktadÕr. økili sulu faz sistemlerinde çok sayÕda polimerle çalÕúÕlmÕútÕr; Dekstran / PEG, Dekstran / Fikol, PEG / Fikol, PEG / Tuz sistemleri. Bu sistemlerle ilgili faz diyagramlarÕ pek çok literatürde bulunmaktadÕr. Endüstriyel uygulamalar için yüksek saflÕktaki dekstran oldukça pahalÕdÕr ve bu 63 nedenle bu uygulamalar için PEG/tuz sistemleri daha uygun proseslerdir (Synder et al., 1992). Genellikle polimer konsantrasyonunun artmasÕ ile proteinlerin da÷ÕlÕmÕ tek taraflÕ olacaktÕr; bu da da÷Õlma katsayÕsÕnÕn birin yukarÕsÕna çÕkmasÕ ya da birin altÕna düúmesi demektir. E÷er bir polimer türü kendisinden daha düúük molekül kütleli polimer türü ile yer de÷iútirirse, proteinlerin da÷ÕlÕmÕ polimeri içeren faza do÷ru olacaktÕr. Bu sebeple genelde yüksek molekül kütleli ve düúük konsantrasyona sahip polimerler tercih edilmektedir. Polimer konsantrasyonun artmasÕ ile yo÷unluk, refraktif indeks ve fazlar arasÕndaki viskozite yükselecektir (Albertsson, 1986). Polietilen glikol (PEG) hidrofobik karaktere sahip bir polimerdir. Bu nedenle molekül kütlesinin artmasÕ ile hidrofobik karakteri de artacaktÕr (Vaidya et al., 2006). PEG’in molekül kütlesinin protein da÷ÕlÕmÕna etkisi Flory Huggins teorisi temel alÕnarak açÕklanmaktadÕr. PEG ve protein arasÕndaki tercihli iliúki PEG’in molekül kütlesindeki artÕúÕn bir noktadan sonra proteini dÕúlamaya baúladÕ÷Õ andan itibaren azalmaktadÕr. Bu dÕúlama etkisi ile proteinler tuz fazÕna do÷ru yönelirler. Bu nedenle yüksek molekül kütlesine sahip PEG türleri, protein saflaútÕrÕlmasÕnda saflaútÕrÕlmasÕ hedeflenen proteinin verimini düúürece÷inden pek tercih edilmezler (Klomklao et al., 2005). Düúük moleküler kütleye sahip PEG türleri ise neredeyse sistemdeki tüm proteinleri üst faza çekecektir. Bunun sonucunda ise kontamine proteinlerden dolayÕ çok etkisiz bir ayÕrma ve saflaútÕrma meydana gelecektir. Bu yüzden genellikle orta dereceli PEG molekül kütleleri tercih edilmektedir. PEG’in hidrofobik karakteri artÕkça hidrofobik karakterdeki proteinlerde üst faza daha kuvvetli gitme e÷ilimindedir. 64 Ancak seçimli bir ayrÕm ve saflaútÕrma iúlemi için optimum bir PEG konsantrasyonu ve molekül kütlesi seçilmelidir (Su and Chiang, 2006). 2.4.2 Tuz türü ve konsantrasyonunun etkisi Sulu ikili faz sistemlerinde genellikle (NH4)2SO4, Na2SO4, KH2PO4, K2HPO4, NaH2PO4, Na3C6H5O7 ve MgSO4 gibi tuzlar faz oluúturmada kullanÕlÕr. Tuzlar sulu ikili faz sisteminde genellikle fazlar arasÕndaki hidrofobisiteyi artÕrarak PEG ve protein arasÕndaki hidrofobik etkileúimi daha da artÕrÕr ve bunun sonucunda daha iyi bir ekstraksiyon gerçekleúmiú olur (Su and Chiang, 2006). Sulu ikili faz sistemlerinde tuz türü ve konsantrasyonu biyolojik moleküllerin da÷Õlma davranÕúÕnÕ ve ekstraksiyon verimliliklerini etkilemektedir. Sulu ikili faz sistemlerinde tuzlarÕn da÷Õlmaya etkisi alt ve üst faz arasÕnda tuz iyonlarÕnÕn eúit olmayan bir úekilde da÷ÕlmasÕ ve bunun sonucunda meydana gelen elektrik akÕmÕndaki farklÕlaúma úeklindedir. Bu farklÕlaúmadan dolayÕ pek çok durumda alt faz negatif yüklü, üst faz ise pozitif yüklüdür. Bunun sonucunda negatif yüklü proteinler elektrostatik itme kuvvetleriyle üst faza gitmektedir (Han and Lee,1997). Da÷Õlmaya etki eden tuzlarÕn hidrofobik karakteri, fazlar arasÕndaki elektrik potansiyeli, moleküllerin büyüklü÷ü ve konformasyonu gibi faktörlerden en dominant faktör hidrofobik karakteristikliktir. Hidrofobik etki moleküllerin apolar kalÕntÕlarÕnÕn su ile olan etkileúimi olarak açÕklanmaktadÕr. AyrÕca, bir materyalin hidrofobisitesi sulu ortamdaki hidrojen ba÷Õ, van der Waals, elektrostatik etkileúim gibi bütün 65 etkileúimlerinin ölçümü olarak da tanÕmlanabilmektedir (Vailaya and Horváth, 1996). PEG / Tuz sistemlerinde tuz türü ve konsantrasyonu proteinler ve hidrofobik ortam arasÕndaki hidrofobik etkileúimlere etki eder. Tuz iyonlarÕ protein üzerindeki kendisine zÕt yüklü iyonlarla etkileúerek çift katlÕ iyon gruplarÕ oluúturur. Sonuçta proteini saran tuzlarÕn etrafÕndaki su molekülleri uzaklaúÕr ve proteinlerin hidrofobik bölgeleri tuz konsantrasyonunun artmasÕyla kademeli olarak açÕkta kalmaya baúlar (Bonomo et al., 2006). Tuz iyonlarÕnÕn proteinin davranÕúÕna etkisi genellikle Hofmeister serisindeki pozisyonlarÕyla iliúkilidir. Hofmeister serisi anyonlar için; SO4-2 > HPO4-2 > CH3COO- > Cl- > Br- > I- > SCNve katyonlar için; Li+ > Na+ > K+ > NH+4> Mg+2 úeklinde etki etmektedir. Yüksek tuz konsantrasyonlarÕnda serilerin sol tarafÕndaki iyonlar “salting-out” etkisiyle proteinlerin çözünürlüklerini düúürerek hidrofobik etkileúimlerini artÕrÕrlar. Bu yüzden ço÷u protein tuzca fakir PEGce zengin üst faza gitmeyi tercih eder (Silva et al., 2007). Yüksek tuz konsantrasyonlarÕ, proteinlerin üst faza da÷ÕlmasÕ, saflaútÕrmanÕn verimi, proteinlerin çökelmesi, enzimlerin aktivitesinin kaybolmasÕ gibi pek çok soruna neden olabilmektedir. Bu nedenle tuz türü ve konsantrasyonu saflaútÕrÕlmasÕ hedeflenen proteinin iyi bir saflaútÕrma katsayÕsÕ ve geri kazanÕmla saflaútÕrÕlabilmesi için kritiktir ve en uygun optimum koúullarÕ belirlenmelidir (Klomklao et al., 2005). 2.4.3 pH etkisi økili sulu faz sistemlerinde proteinlerin da÷ÕlÕmÕ sistemin pH’Õna da ba÷lÕdÕr. Spesifik bir sistemdeki proteinin da÷Õlma katsayÕsÕndaki 66 de÷iúimler ve pH aralÕ÷Õ iyonik kompozisyon tarafÕndan etkilenmektedir. Sulu ikili faz sisteminin pH’Õ proteinin iyonize olabilen gruplarÕnÕ ve yüzeyindeki yüklere etki etmektedir. pH’Õn de÷iútirilmesiyle proteinlerin net yükü düúük pH’da pozitif, yüksek pH’da ise negatif olmaktadÕr. Proteinler izoelektrik noktadaki pH’da net sÕfÕr yüke sahiptir ve bu noktada protein da÷ÕlÕmÕ pH’dan ba÷ÕmsÕz olarak hareket etmekte olup ço÷unlukla PEG ve tuzun protein üzerindeki hidrofobik etkileúimleri kuvvetlidir. øzoelektrik noktanÕn üstündeki pH de÷erlerinde ise iyonik etkileúimler hidrofobik da÷ÕlÕmÕndan üstün gelecektir ve negatif yüklü proteinler/enzimler pozitif yüklü üst faza do÷ru da÷ÕlacaktÕr (Johansson, 1985; Vaidya et al., 2006; Babu et al., 2007). 2.4.4 SÕcaklÕ÷Õn etkisi Son zamanlarda yapÕlan çalÕúmalarda ifade edildi÷i gibi polimertuz etkileúimleri endotermik yani ÕsÕ alan etkileúimlerdir ve bu nedenle sÕcaklÕ÷Õn artmasÕ bu reaksiyonun gerçekleúmesini daha da istemli kÕlacaktÕr (Carvalho et al., 2007). SÕcaklÕk iki fazÕn kompozisyonunu etkileyerek proteinin da÷ÕlÕmÕna etki edece÷inden ve ayrÕca polimerin ve tuzlarÕn sudaki çözünürlükleri sÕcaklÕkla farklanaca÷Õndan dolayÕ önemli bir parametredir. Faz oluúumu için sistem sÕcaklÕ÷Õ polimer ve tuzlarÕn kritik sÕcaklÕ÷ÕnÕn üzerinde olmalÕ ve sÕcaklÕ÷Õn sabit tutulmasÕ gerekmektedir. AyrÕca proteinler faz oluúturan polimerlerin varlÕ÷Õnda denaturasyona karúÕ daha dayanÕklÕ olduklarÕndan yüksek sÕcaklÕklarda bile proteinlerin da÷ÕlÕmÕ gerçekleúebilmektedir (Bamberger et al., 1985). 67 2.4.5 Hidrofobik etkileúimler Polimerlerden bir tanesine hidrofobik gruplarÕn kovalent ba÷lanmasÕyla hidrofobik etkileúimler artÕrÕlabilmektedir. E÷er bir protein yüzeyinde veya aktif merkezinde hidrofobik gruplar varsa da÷Õlma katsayÕsÕ de÷iútirilebilmektedir. Bu iúleme afinite da÷ÕlÕmÕ da denilmektedir. Yöntem hücrelerin veya hücre partiküllerinin hidrofobik özelliklerini karakterize etmekte ve hidrofobikli÷e ba÷lÕ olarak ayÕrmada kullanÕlabilmektedir (Albertsson, 1986). 2.4.6 Protein konsantrasyonunun etkisi Protein konsantrasyonu doygunluk sÕnÕrÕna yaklaútÕkça, sistemde doygun hal durumu gözlenecektir. Protein konsantrasyonunun bu sÕnÕrÕn üzerine çÕkarÕlmasÕ proteinin çökmesine neden olacak ve sonuçta da geri kazanÕmÕ düúük olacaktÕr. Bu nedenle, sulu ikili faz sisteminde protein konsantrasyonu doygunluk sÕnÕrÕnÕn altÕnda olmalÕdÕr. Genellikle bir gramlÕk bir ikili faz sistemine 1 mg protein konsantrasyonu optimumdur. 2.4.7 ZamanÕn etkisi Küçük damlalarÕn karÕútÕrma sÕrasÕnda bütünleúerek büyük damlalar oluúturmasÕ ve en sonunda da sistemin disperse halden homojen bir hal almasÕ için belli bir zamanÕn geçmesi gerekmektedir. FazlarÕn farklÕ yo÷unluk ve viskozite özelliklerinden dolayÕ faz ayrÕmÕnÕn gerçekleúmesi sistemden sisteme farklÕ zamanlarda gerçekleúir. PEG/dekstran ve PEG/tuz sistemleri en kÕsa zamanda oluúan sistemlerdir (Albertsson, 1986). 68 2.4.8 Düúük molekül kütleli maddelerin etkisi øyonik olmayan polimerlerden oluúan sistemler 0.1–1 M arasÕndaki úeker veya NaCl, KCl, Na2CO3, NaClO4 gibi tuzlarÕn ilavesinden oldukça etkilenmektedir. Bu maddelerin eklenmesiyle faz diyagramÕ ve kritik nokta çok fazla etkilenmemektedir. Faz sistemi sadece 1 M’dan yüksek tuz konsantrasyonlarÕndan etkilenmektedir (Albertsson, 1986). Sulu ikili faz sistemine faz oluúturucu tuzun yanÕnda ikinci bir tuzun sisteme eklenmesi spesifik proteinlerin da÷Õlma katsayÕsÕnÕ de÷iútirme olana÷ÕnÕ arttÕrÕr (Yue et al., 2007). 2.5 Sulu økili Faz Sisteminin Uygulamala AlanlarÕ Protein gibi biyolojik moleküller genellikle çok seyreltik solüsyonlarda bulunmaktadÕr ve bu yüzden geri kazanÕmÕnda genellikle ilk adÕm deriútirme iúlemi olmaktadÕr. Özellikle rekombinant DNA uygulamalarÕnÕn artmasÕ protein üretiminde geleneksel proseslere ve ürünlerin geri kazanÕmÕna yeni bir bakÕú açÕsÕ oluúturmuútur. Geleneksel yöntemlerde saflaútÕrma iúlemi santrifügasyon, filtrasyon ve deriútirme gibi birkaç adÕmdan oluúmaktadÕr. Ço÷u zaman proses sayÕsÕnÕn veya adÕmlarÕnÕn artmasÕ hem zaman kaybÕna yol açmakta hem de ürün kaybÕnÕ artÕrmaktadÕr. Sulu ikili faz sistemi, geleneksel yöntemlerdeki bu eksikliklerin üstesinden gelmektedir. Uygun bir optimizasyona sahip sulu ikili faz sistemi, berraklaútÕrma, deriútirme ve kÕsmi saflaútÕrma adÕmlarÕnÕn entegre oldu÷u tek adÕmlÕ bir saflaútÕrma prosesi sa÷layarak hem ürün verimini geliútirmekte hem de ürün geri kazanÕm maliyetini azaltmaktadÕr. Uygun faz kompozisyonlarÕ seçilerek bir yada daha fazla adÕmlÕ sulu ikili faz sistemleri kullanÕlarak biyolojik moleküllerin saflaútÕrÕlmasÕ gerçekleútirilebilmektedir. Örne÷in; Rhodotorula glutinis 69 fenilamonyak liyaz (PAL, EC 4.1.3.5) enzimi geleneksel tuz çöktürme yöntemleri ile 1.32–2.5 kat arasÕnda saflaútÕrÕlÕrken, yöntemin verimi % 52.8–80.0 arasÕnda de÷iúmektedir. Enzim sulu ikili faz sistemi ile önce % 11.0 PEG-1000 / % 14.0 Na2SO4 ve daha sonra ikinci adÕmda % 11.0 PEG-1000 / % 14.0 Na2SO4 / % 5.3 Na2CO3 sistemi ile 9.3 kat saflaútÕrma katsayÕsÕ ve % 80.6 verim ile saflaútÕrÕlmÕútÕr (Yue et al., 2007). Tavuk yumurtasÕ lizozim (EC 3.2.1.17) enzimi % 16.1 PEG–6000 / % 12 Na2SO4 / 500 mM NaClO4 (25oC ve pH 10.0) sulu ikili faz sistemi sayesinde oldukça verimli ve ekonomik bir úekilde (7.6 kat ve % 70 verim ile) saflaútÕrÕlmÕútÕr (Su and Chiang, 2006). Bacillus pumilus alkali ksilanaz (EC 3.2.1.32) enzimi % 22 PEG–6000 / %10 K2HPO4 / % 12 NaCl sulu ikili faz sistemi ile 33.1 kat ve % 98 verim ile saflaútÕrÕlmÕútÕr (Bim and Franco, 2000). Tuna dalak proteinaz enzimi ise % 15 PEG1000 / % 20 MgSO4 sistemi ile 6.61 kat ve % 69 verim ile saflaútÕrÕlmÕútÕr (Klomklao et al., 2005). Sulu ikili faz sistemi ayrÕca bitki dokularÕndan enzimlerin verimli bir úekilde saflaútÕrÕlmasÕnda da kullanÕlmaktadÕr. Örne÷in; Sesbania marginata bitkisine ait bakla tohumundan Į-galaktozidaz (EC 3.2.1.22) enzimi % 13 PEG-4000 / % 13 fosfat / % 6 NaCl (pH 5.0) sulu ikili faz sistemi ile 5.4 kat saflaútÕrma katsayÕsÕ ve % 144 verim ile kontaminatlarÕn ço÷undan ayrÕlarak ikinci adÕmda planlanan iyonde÷iúim kromatografisi için uygun bir enzim preparatÕ elde edilmiútir (Falco et al., 2000). Patates yumrusundan polifenol oksidaz (PPO, EC 1.14.18.1) enzimi % 5 PEG–8000 / % 28.5 fosfat (pH 7.0) sistemi ile 15.7 kat saflaútÕrma katsayÕsÕ ve % 97 verim ile saflaútÕrÕlmÕútÕr (Vaidya et al., 2006). Ipomoea palmetta bitkisinin yapraklarÕndan peroksidaz (POD, EC 1.11.1.7) enzimi PEG / amonyum sülfat sistemi ve ardÕndan jel fitrasyon kromatografisi ile saflaútÕrÕlmÕútÕr. % 24 PEG-6000 / % 7.5 (NH4)2SO4 / % 2.0 NaCl sistemi kullanÕlarak ekstrakt hacminde istenen 70 deriútirme sa÷lanmÕú ve enzim 0.042 da÷Õlma katsayÕsÕ, 2.18 saflaútÕrma katsayÕsÕ, % 91.5 verim ve % 57.5 hacim azalmasÕ ile deriútirilerek saflaútÕrÕlmÕútÕr (Srinivas et al., 1999). Sulu ikili faz sistemi, DNA izolasyonunda geleneksel yöntemler olarak bilinen izopropanol ve amonyum sülfat çöktürmelerine gerek duyulmadan tek adÕmda ve hÕzlÕ bir úekilde DNA izolasyonunun gerçekleúmesini sa÷lamaktadÕr (ùekil 2.5). Kaotropik ajan ve deterjan içeren PEG/Tuz sistemleri ile alt fazda nükleik asit da÷ÕlÕmÕ oldukça yüksek bir verimle sa÷lanmaktayken istenmeyen proteinler ve di÷er hücresel materyaller üst faza da÷ÕlmaktadÕr. Örne÷in; Escherichia coli hücrelerinin lizisi ile açÕ÷a çÕkan alkali lizatta yer alan plazmid DNA’sÕ (pDNA) % 19 PEG-600 / % 16.5 sodyum sitrat-amonyum sülfat / % 20 lizat (pH 6.9) sistemi ile tuzca zengin alt fazda % 91.1 verim ve % 17.2 saflÕkta izole edilmektedir. Sulu ikili faz sisteminin birkaç adÕmda tekrarlanmasÕyla pDNA üst fazda daha yüksek saflÕkta elde edilmiútir (Gomes et al., 2008). Bir baúka çalÕúmada ise 6.1 kbp’lÕk plazmid DNA (pDNA) vektörü % 35 PEG-600 / % 6 (NH4) 2SO4 sistemi ile istenmeyen pek çok RNA ve proteinden uzaklaútÕrÕlarak 3.0 kat ve % 100 geri kazanÕm ile saflaútÕrÕlmÕútÕr (Trindade et al., 2005). 71 ùekil 2.5 Sulu ikili faz sistemi ile DNA izolasyonu Membran proteinlerinin izolasyonu normalde oldukça zor ve zaman isteyen bir prosedürdür. Ancak sulu ikili faz sistemi kullanÕlarak bu sorunun üstesinden gelmek mümkündür. Non-iyonik deterjanlar (Örne÷in; Triton X-114 gibi) kullanÕlarak yüksek sÕcaklÕklarda kompleks biyolojik sistemlerden integral membran proteinlerince zengin preparatlar hazÕrlanabilmektedir. Örne÷in; Nocardia rhodochrous kolesterol oksidaz (EC 1.1.3.6) enzimi etoksilenmiú non-iyonik C1218E05 deterjanÕ ile oluúturulmuú sulu ikili faz sistemi ile 20 saatlik bir prosedür kullanÕlarak 4.0 kat saflaútÕrma katsayÕsÕ ve % 85’lik verimle saflaútÕrÕlabilmiútir (Minuth et al., 1997). 11-ȕ-hidroksistreoid dehidrogenaz membran proteini ilk adÕmda Tween 20 / Dekstran 500 sistemi ile in-situ olarak % 75 geri kazanÕmla üst fazda (deterjan fazÕ) toplanmÕútÕr. Ancak protein yeterli saflÕkta olmadÕ÷Õ için alt faz (polimer fazÕ) atÕlmÕú ve ikinci adÕmda sisteme metal afinite reçinesi içeren bir polimer ilave edilerek son adÕmda alt fazda membran proteinin seçimli 72 bir úekilde saflaútÕrÕlmasÕ sa÷lanmÕútÕr (ùekil 2.6) (Roobol-Bóza et al., 2004). ùekil 2.6 Sulu ikili faz sistemiyle membran proteinin izolasyonu Sulu ikili faz sistemi ile aminoasit, peptid gibi düúük molekül kütleli biyomoleküllerin ekstraksiyonunun yapÕlabildi÷i de çeúitli çalÕúmalarda ifade edilmiútir. økili faz sistemleri ile aminoasitlerin hidrofobik karakterleri arttÕrÕlarak çok verimli bir ekstraksiyonla PEGce zengin üst fazda toplanmalarÕ sa÷lanmÕútÕr. ArdÕndan ekstraktta PEG so÷utularak çöktürülmüú ve oldukça temiz bir çözelti elde edilmiútir. Bu çalÕúmalar kompleks proteinlerin sulu ikili faz sistemlerindeki davranÕúlarÕnÕ anlamada da yardÕmcÕ olmaktadÕr (Eiteman and Gainer, 1990). Örne÷in; Polipropilen glikol (PPG425) / MgSO4 sulu ikili faz 73 sisteminde D-alanin, L-valin ve L-lösin aminoasitlerinin da÷ÕlÕmÕ incelenmiútir (Salabat et al., 2007). PEG / Dekstran sistemi ile glutamik asitin, fenilalanin ve triptofan aminoasitlerinden ayrÕlmasÕ gerçekleútirilmiútir (Zhai et al., 2001). Aminoasitlerin rasemik karÕúÕmlarÕndan enzimatik olarak üretilen L-aminoasitlerin saflaútÕrÕlmasÕnda PEG-600 / Potasyum fosfat sulu ikili faz sistemi kullanÕlmÕútÕr (Hollander et al., 1999). Hiç úüphe götürmez ki biyoteknoloji alanÕnda en fazla ilgiyi ham materyallerden protein izolasyonu ve saflaútÕrÕlmasÕnÕ sa÷layan sulu ikili faz sistemleri çekmektedir. Sulu ikili faz sistemleri sanayide büyük ölçeklerde protein geri kazanÕmÕ için de kullanÕlmaktadÕr. Örne÷in; % 12.5 PEG–1000 / % 12.5 K2HPO4 sistemi ile laboratuvar ortamÕnda 500 ml’de 176 mg kadar saflaútÕrÕlan lizozim ve miyoglobin, 6.25 litreye büyütülmüú sistemde 2.2 gr kadar saflaútÕrÕlmaktadÕr (Sutherland et al., 2008). Escherichia coli homojenatÕndan ZZ-kutinaz-(WP)4 proteini iki adÕmlÕ sulu ikili faz sistemi (EO50PO50 / Amilopektin - EO50PO50 / C1218EO5) ile 500 litrelik bir fed-batch reaktöründe yaklaúÕk konsantrasyonu 2.36 gr/lt olacak úekilde elde edilmiútir (Kepka et al., 2003). PEG-4000 / CaCl2 sistemi ile Zea mays mÕsÕr bitkisinin maltÕndan Į- ve ȕ-amilazlarÕn 130 kat saflaútÕrma katsayÕsÕna sahip sürekli bir ekstraksiyon sistemi ile saflaútÕrÕldÕ÷Õ belirtilmiútir (Biazus et al., 2007). Sürekli karÕútÕrmalÕ kontaktör (ùekil 2.7) içerisinde Clostridium perfringens Tip A mikroorganizmasÕnÕn bulundu÷u ham materyalden PEG / Fosfat sulu ikili faz sistemi kullanÕlarak Į-toksin ekstraksiyonu 2.4 kat saflaútÕrma katsayÕsÕ ile gerçekleútirilmiútir (Cavalcanti et al., 2007). Ancak, sulu ikili faz sisteminin sahip oldu÷u bütün iyi özelliklere ra÷men da÷Õlma mekanizmasÕ tam olarak bilinmedi÷inden büyük sistemdeki çalÕúmalarÕn deneysel olarak optimize edilmesi gerekmektedir ve bu sebeple ölçek büyütme çalÕúmalarÕ henüz çok sÕnÕrlÕdÕr. 74 ùekil 2.7 Sürekli karÕútÕrmalÕ kontaktör Sulu ikili faz sistemleri sadece biyoteknolojik alanda de÷il ayni zamanda analitik uygulamalara da sahiptir. Sulu ikili faz sisteminde moleküllerin da÷ÕlmasÕ faz komponentlerinin etkilerinin yanÕnda kendilerinin yüzeysel ve konformasyonel özelliklerinden de kaynaklandÕ÷Õndan analitik analizler yapÕlabilmektedir. Sulu ikili faz sistemleri hücre fragmanlarÕnÕ alt populasyonlara ayÕrarak yük ve yüzeysel hidrofobik özellikleri hakkÕnda ve ayni zaman da tuz ve pH koúullarÕnÕn de÷iútirilmesi ile proteinlerin izoelektrik noktalarÕnÕn belirlenmesini sa÷lamaktadÕr (Hatti-Kaul, 2000). Örne÷in; PEG–8000 / Fosfat sulu ikili faz sistemi E. coli hücresinin fragmanlarÕndan inklüzyon parçalarÕnÕ fraksiyonlara ayÕrmÕútÕr (Walker and Lyddiatt, 1998). Çevresel sorunlarÕn çözülmesinde de sulu ikili faz sistemlerinden yararlanÕlmaktadÕr. Endüstriyel alanda kesim, delim, ezme gibi proseslerde kullanÕlan su bazlÕ so÷utucu sÕvÕlarda meydana gelen 75 mikrobiyal büyümenin biyodegrasyonunu sa÷lamak zordur ayrÕca operatorler için mesleki riskler taúÕmaktadÕr. Sulu ikili faz sistemi bu so÷utucu sÕvÕlardan mikroorganizmalarÕn ve inorganik partiküllerin uzaklaútÕrÕlmasÕnda kullanÕlabilmektedir. AyrÕca tekstil de kullanÕlan boyalar, çevre kirlili÷ine yol açan metal iyonlarÕ ve organik maddeler, ham petroldeki aromatiklerin uzaklaútÕrÕlmasÕ gibi atÕklarÕn de÷erlendirilmesinde sulu ikili faz sistemlerinin kullanÕlabilece÷i düúünülmektedir (Hatti-Kaul, 2000). 76 3. MATERYAL VE METOD 3.1 Materyal Bu çalÕúmada kullanÕlan cihazlar ve yöntemlere ait bilgiler ilgili bölümlerde ayrÕntÕlÕ olarak verilmiútir. KullanÕlan kimyasal maddeler; D(+)-glukoz monohidrat (C6H12O6.H2O), Polietilen Glikol (PEG 1000, 2000, 3000, 4000, 6000 ve 8000) ve Sükroz (C12H22O11) Fluka-Biochemika’dan, Amonyum Sülfat ((NH4)2SO4), HCl, Magnezyum Sülfat (MgSO4), Sodyum Sülfat (Na2SO4), Potasyum Klorür (KCl), Sodyum Klorür (NaCl), Sodyum Karbonat (Na2CO3), Magnezyum Klorür (MgCl2), Baryum Klorür (BaCl2.2H2O), Kalsiyum Klorür (CaCl2), Mangan Sülfat (MnSO4.H2O), Çinko Sülfat (ZnSO4.7H2O), Demir Klorür (FeCl3.6H2O), E. Merck (Darmstad- FRG)’den, Tris Hidroksi Amino Metan, Sodyum Dodesil Sülfat (SDS), Akrilamid, N,N'-Metilenbisakrilamid, N,N, N',N' – Tetrametilenetilendiamin (TEMED), Amonyum persülfat, 2merkaptoetanol, Glisin ve Coomasie-Brilliant Blue Bio-Rad laboratuarlarÕ, (Richmond CA) ve BDH Ltd. (Poole,UK)’den temin edilmiútir. Na/K Tartarat(C4H4KNaO6.4H2O), Sodyum hidroksit, Etanol, Fosforik asit, BakÕr Sülfat (CuSO4.5H2O), Mangan Klorür (MnCl2.4H2O) ve Asetik asit Riedel-de Haën’den, Sodyum Asetat, 3,5-Dinitrosalisilik Asit, SÕ÷Õr Serum Albumini (Albumin Fraksiyon V) ve Sigma Molecular Weight Marker (M.W. 14,000–66,000) Sigma Chemical Co. (St. Louis, CA)’den temin edilmiútir. KullanÕlan di÷er kimyasallar analitik saflÕktadÕr. 77 ønvertaz kayna÷Õ olarak kullanÕlan domatesler (Lycopersicon esculentum) lokal marketlerden satÕn alÕnmÕútÕr. YapÕlan ön çalÕúmalar do÷rultusunda halk arasÕnda salkÕm domates olarak bilinen ve Salih Öztim adlÕ üretici tarafÕndan øzmir’in øncirliova bölgesinde yetiútirilen domateslerin uygun enzim kayna÷Õ olaca÷Õ belirlenmiútir. 3.2 ønvertaz Aktivitesi Tayini ønvertaz enziminin aktivite tayininde esas, substrat olarak Sükroz kullanÕlarak enzimatik reaksiyon sonucunda açÕ÷a çÕkan invert úekerin miktarÕnÕn Dinitrosalisilik (DNS) asit metodu ile belirlenmesidir. Aktivite tayininde inkübasyonlar Stuart Scientific çalkalamalÕ su banyosunda (SBS–35), spektrofotometrik ölçümler ise Perkin Elmer marka cihazla gerçekleútirilmiútir. DNS metodunun esasÕ indirgen úekerlerdeki serbest karbonil gruplarÕnÕn (C=O) varlÕ÷ÕnÕ test etmekdir. Bununla birlikte glukozdaki fonksiyonel aldehit grubu ile fruktozun fonksiyonel keton gruplarÕnÕn oksidasyonunu ve ayni anda alkali koúullar altÕnda 3,5-Dinitrosalisilik asitin 3-amino,5-nitrosalisilik asite indirgenmesini içermektedir (ùekil 3.1). Aúa÷Õdaki reaksiyon úemasÕ bir mol úekerin bir mol 3,5-Dinitrosalisilik asit ile reaksiyona girdi÷ini göstermektedir. Oluúan nitroaminosalisilik asit boyar maddesinin konsantrasyonu 546 nm’de spektrofotometrik olarak ölçülebilmektedir. Aldehit grubu oksidasyon o karboksil grubu 3,5-Dinitrosalisilik asit o 3-amino,5-nitrosalisilik asit indirgenme ùekil 3.1 DNS yönteminin prensibi 78 ønvertaz enzimi ùekil 3.2’de gösterilen reaksiyon ile sükrozun hidrolizini katalizler. Bu hidroliz reaksiyonu sonucu oluúan monosakkarit karÕúÕmÕna “invert úeker” denir ve açÕ÷a çÕkan glukoz ile fruktoz indirgen úekerdirler ve bazik bir çözeltide aldehit ve keton oluútururlar. ùekil 3.2 Sükrozun invertaz tarafÕndan hidroliz reaksiyonu YapÕlarÕndaki anomerik karbonu açÕkta olan úekerler indirgen úekerdir. Bunlar kimyasal olarak düz zincirli olabilecekleri gibi halka yapÕsÕnda da bulunabilmektedir ve bu iki yapÕ formu kendi aralarÕnda dengededir. Hemi-asetal veya hemi-ketal gruplarÕ boúta olduklarÕnda indirgen úekerler alkali koúullar altÕnda ortamda bulunacak oksitleyici etkenler (Örne÷in; Cu+2) karúÕsÕnda indirgeyici bir madde haline gelmektedir; úekerin karbonil grubunun oksijen molekülü ile yükseltgen arasÕnda oluúan olan redoks tepkimesi yükseltgeni indirgemektedir. Bir úeker oksitlendi÷i zaman onun karbonil gruplarÕ (Örne÷in; aldehit ve keton gruplarÕ) karboksil grubuna dönüúmektedir. Örne÷in; glukoz kimyasal olarak sulu çözeltide glukopiranoz formu ile dengede olan aldehit formunda bir aldoheksozdur. Fizyolojik pH’da glukopiranoz yapÕsÕ üstün úekildir. Aldehit endiol dengesi, glukozun kolaylÕkla indirgenmesini ve yükseltgenmesini sa÷lar. Yani glukozun formülü aldehit ya da kÕsa ömürlü reaktif tür olan enol úeklinde yazÕlabilir. Aúa÷Õda ùekil 3.3’de belirtildi÷i gibi alkali çözeltilerde enol anyonuna 79 dönüúüm tercih edilmektedir. Çifte ba÷Õn varlÕ÷Õ ve enol anyonundaki negatif yük, glukozu bakÕr (Cu+2) ve demir (Fe+3) gibi orta derecede oksitleyici etkenlerle oksitlenebilen aktif bir redükleyici madde (indirgen úeker) haline getirir. SÕcak alkali çözeltide glukoz, Cu+2 (küprik) iyonlarÕnÕ hemen Cu+1 (küproz) iyonlarÕna indirger. ùekil 3.3 Glukozun enol anyonuna dönüúüm reaksiyonu DNS reaktifinin hazÕrlanÕúÕ; 1 g DNS 20 ml 2 N NaOH çözeltisine eklenir, ÕsÕtÕlarak çözülür ve son hacim distile su ile 50 ml’ye tamamlanÕr. Daha sonra üzerine 30 g Na/K Tartarat ilave edilir ve karÕútÕrÕlarak toplam hacim distile su ile 100 ml’ye tamamlanÕr. ønvertazÕn aktivite ölçümünde reaksiyon karÕúÕmÕ; 0,6 ml, 0,2 M, sodyum asetat tamponu (pH 5,0), 0,2 ml, 0,5 M sükroz (asetat tamponunda hazÕrlanmÕú) ve 0,2 ml uygun oranda seyreltilmiú enzim çözeltisi içerir. Reaksiyon karÕúÕmÕ, 37oC’de 30 dakika boyunca lineer karÕútÕrmalÕ su banyosunda (SBS–35, Stuart Scientific, UK) çalkanalarak inkübe edilir. ønkübasyondan sonra reaksiyon ortamÕndan alÕnan 1 ml örnek üzerine 1 ml DNS reaktifi ilave edilerek kaynar su banyosunda 10 dk inkübe edilir. KarÕúÕm so÷utulduktan sonra 10 ml bidestile su ilave edilerek vorteks ile karÕútÕrÕlÕr ve açÕ÷a çÕkan invert úeker miktarÕ 546 80 nm’de spektrofotometrik olarak belirlenir. Kör; 0,2 ml enzim çözeltisi yerine 0,2 M, sodyum asetat tamponu (pH 5,0) içerir. Enzim aktivite miktarlarÕnÕn hesaplanmasÕnda 1–10 ȝmol glukoz konsantrasyon aralÕ÷Õ ile hazÕrlanan standart grafi÷i kullanÕlÕr. Bir invertaz aktivite birimi, yukarÕda belirtilen koúullar altÕnda dakikada 1 ȝmol glukoz açÕ÷a çÕkaran enzim miktarÕ olarak tanÕmlanmÕútÕr (IU/ml). 3.3 Protein Tayini (Bradford Metodu) ønvertaz preparatlarÕnÕn protein konsantrasyonlarÕnÕn tayini Bradford (Bradford, 1976) metodu ile gerçekleútirilmiútir. Boya ba÷lama temelli yöntemlerin en yaygÕnÕ, Bradford tarafÕndan geliútirilen ve Coomassie Brillant Blue G–250 boyasÕnÕn kullanÕldÕ÷Õ yöntemdir. Yöntem, organik boyalarÕn asidik gruplarÕ ile proteinlerin bazik gruplarÕnÕn (Lys, Arg) etkileúerek renk oluúturmasÕnÕ esas almaktadÕr. SÕ÷Õr serum albümininin (BSA), distile suda hazÕrlanmÕú 1 mg/ml’lik stok standart çözeltisinden 0,02–0,25 mg/ml konsantrasyon aralÕ÷Õ ile hazÕrlanan standart grafi÷i kullanÕlarak örnek protein konsantrasyonlarÕ hesaplanmÕútÕr. Protein tayini için gerekli olan Bradford reaktifi: 40 mg Coomassie Brillant Blue G250, % 95’lik 50 ml etanolde çözülür, üzerine 55 ml % 88’lik fosforik asit ilave edilerek distile su ile 1 lt’ye tamamlanÕp filtre edilir. 81 Her bir örne÷in (standartlar ve bilinmeyen protein örnekleri) protein miktarÕ aúa÷Õdaki prosedüre göre belirlenmiútir: a) 0,1 ml standart protein, bilinmeyen protein örne÷i ve distile su (kör için) tüplere pipetlenir. b) 2 ml Bradford reaktifi eklenir ve vorteks ile karÕútÕrÕlÕr. c) Tüm tüpler oda sÕcaklÕ÷Õnda 10 dakika bekletilir d) Her bir örne÷in 595 nm’de absorbansÕ okunur. Protein konsantrasyonlarÕ, hazÕrlanan standart grafi÷i (0,02-0,2 mg/ml BSA standartlarÕ) kullanÕlarak hesaplanÕr. ønvertazlarÕn izolasyonu ve saflaútÕrÕlmasÕ ile ilgili iúlemler sÕrasÕnda gerekli protein tayinleri bu yönteme göre yapÕlmÕútÕr. 3.4. Sodyum Dodesil Sülfat Poliakrilamid Jel Elektroforezi (SDS-PAGE) ve Moleküler Kütle Tayini SDS-PAGE, poliakrilamid jel elektroforezinin en yaygÕn olarak kullanÕlanÕ olup, protein karÕúÕmlarÕnÕn özelliklerini analizlemek açÕsÕndan önemlidir. Protein saflÕk kontrolünün bir ölçüsüdür ve proteinin molekül boyutuna göre bir ayrÕm yapmasÕ nedeniyle ba÷Õl molekül kütlesi tayininde de kullanÕlÕr. O nedenle, domatesten izole edilen invertaz preparatÕnÕn saflÕ÷ÕnÕ kontrol etmek ve molekül kütlesini belirlemek için SDS-PAGE kullanÕlmÕútÕr. Poliakrilamid jel elektroforezi % 0,1 SDS varlÕ÷Õnda plaka jel cihazÕnda Laemmli (Laemmli, 1970) tarafÕndan geliútirilen metoda göre gerçekleútirilmiútir. Yöntem heterojen tampon sistemi temeline dayanÕr. AyÕrma kapasitesi oldukça iyi olan bu yöntemde, çalÕúÕlan proteinler 82 yürütücü jele girmeden önce düzenleyici jelde, elektroforez tamponu ve jel arasÕndaki pH ve iyonik úiddet vasÕtasÕyla dengelenerek konsantre edilirler. Tayin için gerekli olan çözeltiler: Akrilamid/bis 30 g Akrilamid ve 0.8 g bis-N, N¢-Metilenbis(A/B) : akrilamid çözülerek 100 ml’ye tamamlanÕr, filtre edilir ve kahverengi úiúede 4oC’de saklanÕr. Alt Tris (LT): 18.2 g Tris hidroksi aminometan, 2 ml % 20 SDS distile suda çözülür, pH’sÕ deriúik HCl ile 8,8’e ayarlanÕr ve distile su ile 100 ml’ye tamamlanarak 4oC’de saklanÕr. Üst Tris (UT) : : 6.06 g Tris, 2 ml % 20’lik SDS distile suda çözülür, pH’sÕ deriúik HCl ile 6,8’e ayarlanÕr ve distile su ile 100 ml’ye tamamlanarak 4oC’de saklanÕr. Amonyum persülfat(AP) : Rezervuar tamponu 20 mg/ml’lik sulu çözeltisi, taze hazÕrlanÕr. 15 g Tris, 72 g glisin ve 5 g SDS 5 litre distile suda çözülerek hazÕrlanÕr. 3.4.1 Polimerizasyon protokolü Poliakrilamid jeller akrilamid monomerlerinin bir çapraz ba÷layÕcÕ ajan ile kopolimerizasyonu sonucu oluúur. Poliakrilamid jeller için en çok kullanÕlan çapraz ba÷layÕcÕ ajan da N,Nc-metilenbisakrilamid (Bis) dir. Akrilamid polimerizasyonu serbest radikal katalize bir örnektir. Reaksiyon, amonyum persülfat ve N,N,Nc,Nc-tetrametiletilendiamin (TEMED) ile baúlatÕlÕr. TEMED, persülfat iyonunun dekompozisyonunu katalizleyerek serbest bir radikal oluúumunu sa÷lar. Aktif monomer, aktiflenmemiú monomer ile reaksiyon verir ve polimer zincirin uzamasÕ 83 baúlar. Uzayan polimer zincir çapraz ba÷lÕ metilen bisakrilamid ile birlikte yapÕlanÕr. Oksijen, serbest radikalleri uzaklaútÕrdÕ÷Õndan ve polimerizasyonu engelledi÷inden tüm jel çözeltileri kullanÕlmadan önce vakumla oksijen uzaklaútÕrÕlmalÕdÕr. Kaliteli bir SDS-PAGE için úu faktörlere dikkat etmek gerekir: Oldukça yüksek saflÕktaki reaktifler, do÷ru baúlangÕç konsantrasyonlarÕ (yürütücü jel için % 0,04 ve düzenleyici jel için % 0,1), sÕcaklÕk (polimerizasyon için genellikle 23oC), çözeltilerin gazsÕzlaútÕrÕlmasÕ (oksijen polimerizasyonun inhibitörüdür) ve jel oluúturma tamponlarÕnÕn pH’sÕ. Domates invertazÕnÕn SDS-PAGE için % 10’luk akrilamid monomeri kullanÕlmÕútÕr. Polimerizasyon protokolü (iki jel için) aúa÷Õda verilmiútir: Çözelti 1, 2 ve 3 karÕútÕrÕlarak oda sÕcaklÕ÷Õna getirilir. 5 dakikalÕk gazsÕzlaútÕrma iúleminin ardÕndan çözelti 4 ve 5 sÕrasÕyla eklenerek, yavaúça karÕútÕrÕlÕr. Yürütücü jel dökülerek 1–1,5 saat bekletilir. 1) 2) 3) 4) 5) Reaktif Yürütücü Jel (%10) Düzenleyici Jel Distile su (ml) 19 12,7 AB (ml) 25 2,0 LT (ml) 15 5,0 AP (ml) 0,9 0,3 20 20 TEMED (Pl) (%3) 84 3.4.2 Örneklerin hazÕrlanmasÕ ve elektroforez uygulanmasÕ SDS-PAGE’de ayrÕlacak tüm örnekler do÷ru protein yüklemesi yapabilmek için önce 0,1 M Tris/HCl (pH 6,8) ile seyreltilir. Seyreltilmiú örnekler 2:1 oranÕnda ön iúlem tamponu ile karÕútÕrÕlÕr. Bu tampon; 200 Pl Tris/Bromfenol mavisi, 200 Pl % 60’lÕk sukroz, 400 Pl % 20’lik SDS ve 200 Pl 2-merkaptoetanol içerir. Merkaptoetanol proteinin tersiyer yapÕsÕnÕ birarada tutan disülfit ba÷larÕnÕ indirger. SDS; proteini denature ederek kuvvetlice bir SDS molekülü her bir iki aminoasit artÕ÷Õna ba÷lanarak yük maskelenir. Bromfenol mavisi; iyonize olabilen bir boyadÕr ve elektroforezin kolay izlenebilmesi için ortama ilave edilir. Sükroz ise örnek çözeltiye bir yo÷unluk kazandÕrÕr ve örne÷in elektroforez tamponunda kolayca çökmesi sa÷lanÕr. 50 Pl örnek, 25 Pl örnek tamponu ile karÕútÕrÕlÕp 100oC’lik su banyosunda 3 dakika kaynatÕlÕr. Genel olarak yürütücü jelin her aralÕ÷Õna 50 Pl örnek uygulanÕr. Boú aralÕklar ise, elektroforez sÕrasÕnda proteinlerin da÷ÕlmasÕnÕ önlemek için 50 Pl 0,1 M Tris/HCl (pH 6,8) ve ön iúlem tamponu ile doldurulur. Anod ve katod reservuarlarÕndaki Tris/glisin/SDS tamponu ile elektroforez yürütülür. Proteinlerin elektroforezinde düzenleyici jelde 25 mA/jel ve yürütücü jelde 35 mA/jel akÕm uygulanÕr. Bromfenol mavisinin oluúturdurdu÷u bant jele ulaúmadan 0,5 cm önce elektroforez iúlemine son verilir. 85 3.4.3 Protein bantlarÕnÕn boyanmasÕ Jellerin boyanmasÕnda Coomasie-Brilliant Blue metodu kullanÕlmÕútÕr. Bu boyama metodunda esas, boyanÕn asidik pH’da proteinlere ba÷lanmasÕdÕr. Jeller, Coomasie Blue (% 45 metanol/ % 9 asetik asitte hazÕrlanmÕú % 25’lik çözeltisi) çözeltisi ile 1 saat boyunca yavaúça çalkalanÕr. Jelde oluúan mavi zemin, jelin % 10 metanol ve % 14 asetik asitten oluúan sulu çözeltisi ile gece boyunca yÕkanarak boyadan temizlenir. 3.5 Sulu økili Faz Sistemi (ATPS) øle ønvertazÕn Domatesten (Lycopersicon esculentum) øzolasyonu ve SaflaútÕrÕlmasÕ ønvertaz (EC 3.2.1.26) enzim kayna÷Õ olarak, ülkemizde oldukça bol bulunan, ekonomik ve yüksek enzim aktivitesi içeren domates (Lycopersicon esculentum) seçilmiútir. Bir çok invertaz çalÕúmasÕnda enzim, bitkisel ve mikrobiyal kaynaktan bilinen genel izolasyon ve saflaútÕrma metodlarÕ kullanÕlarak izole edilip, saflaútÕrÕlarak, fiziksel ve kimyasal özellikleri belirlenmiútir (Vaidya et al., 2006; Srinivas et al., 1999; Yue et al., 2007). ønvertaz enziminin saflaútÕrÕlmasÕ oldukça zor ve masraflÕ bir iúlemdir. AyrÕca, sonuçta elde edilen enzim genellikle yüksek aktiviteli fakat çok az miktardÕr. Bu nedenle, bu çalÕúmada daha sonraki amacÕmÕza uygun bir enzim preparatÕ hazÕrlamak için invertaz enzimi basit tekniklerle domatesten izole edilerek kÕsmi olarak saflaútÕrÕlmÕútÕr. Enzimin izolasyonu ve kÕsmi saflaútÕrÕlmasÕnda sÕrasÕyla homojenizasyon, santrifüjleme, amonyum sülfat çöktürmesi ve diyaliz iúlemleri yapÕlmÕútÕr. Bu preparat sulu ikili faz sisteminde kullanÕlmÕútÕr. 86 Domatesin dÕú kabuklarÕ uzaklaútÕrÕldÕktan sonra küçük parçalar halinde do÷ranmÕútÕr. ArdÕndan bir litre 1 M NaCl içeren pH 5,0, 0,2 M sodyum asetat tamponu ile önce bir blender (Braun, Almanya) ve sonrasÕnda bir homojenizatör (Silverson STL 2, UK) yardÕmÕ ile homojenize edilmiútir. Homojenat, domatesin kendi yapÕsÕndan gelen lif ve çekirdekleri uzaklaútÕrmak için bir tülbent bezinden süzülmüútür. FiltratÕn pH’sÕ pH 5,7–6,0 arasÕnda ayarlanarak 10000 rpm’de 15 dakika, +4oC’de santrifüjlenmiútir (Hettich 30RF, FRG). Daha sonra santrifüjata % 85’lik amonyum sülfat çöktürmesi yapÕlÕp gece boyunca +4oC’de bekletilmiútir. 10000 rpm’de, +4oC’de 30 dakika santrifüjlenen amonyum sülfatlÕ enzim çözeltisinden enzimatik aktivite içeren çökelek ayrÕlmÕútÕr. Çok az miktarda pH 5,0, 0,2 M sodyum asetat tamponu ile çözülen çökelek gece boyu +4oC’de tampona karúÕ diyalizlenmiútir. Diyaliz adÕmÕnda, diyaliz suyu ilk bir saat sonunda ve sonrasÕnda birkaç kez de÷iútirilerek gece boyunca bÕrakÕlmÕútÕr. Daha sonra diyalizat sonraki çalÕúmalarda kullanÕlmak üzere derin dondurucuda (U÷ur, Nazilli) 20oC’de saklanmÕútÕr. HazÕrlanan bu preparat hem protein miktarÕ hem de invertaz aktivitesi açÕsÕndan sulu ikili faz sistemi için oldukça uygun bir preparattÕr. Daha sonraki çalÕúmalarda kullanÕlacak olan domates invertazÕnÕn protein miktarÕ, aktivitesi ve spesifik aktivite de÷erleri ilgili bölümlerde yeri geldikçe verilmiútir. 3.5.1 Sulu ikili faz sisteminin hazÕrlanmasÕ Stok PEG (% 50, w/w), amonyum sülfat (% 50, w/w), magnezyum sülfat (% 30, w/w) ve sodyum sülfat (% 30, w/w) çözeltileri bidestile su ile hazÕrlanmÕútÕr. Sulu ikili faz sistemi uygun PEG ve tuz miktarlarÕ ile 0,5 ml invertaz diyalizatÕ ilave edilerek 15 ml’lik santrifüj tüplerinde hazÕrlanmÕútÕr. PEG molekül a÷ÕrlÕ÷ÕnÕn (PEG 1000, 2000, 3000, 4000, 87 6000 ve 8000) ve tuzlarÕn ((NH4)2SO4, MgSO4 ve Na2SO4) invertaz enziminin da÷ÕlÕmÕna etkisini incelemek için farklÕ konsantrasyonlarda karÕútÕrÕlmÕútÕr. Sistemlerin faz kompozisyonlarÕ ilgili makalelerde (Yue et al., 2007; Salabat, 2006; Su and Chiang, 2006; Klomkloa et al., 2005; Antov et al., 2006) mevcut olan faz diyagramlarÕna dayanmaktadÕr. 10 gr olan son sistem a÷ÕrlÕ÷ÕnÕ ayarlamak için bidestile su kullanÕlmÕútÕr. Sistemin pH’Õ NaOH veya HCl kullanÕlarak ayarlanmÕútÕr. Fazlar 2–3 dakika hafif bir vorteks ile karÕútÕrÕlmÕú ve faz ayrÕmÕnÕn gerçekleúmesi için oda sÕcaklÕ÷Õnda 15 dakika bekletildikten sonra 4000 rpm’de 10 dakika santrifüjlenmiútir (Hettich 30RF, FRG). Alt ve üst fazlar pasteur pipeti ile dikkatlice birbirinden ayrÕldÕktan sonra hacimleri kaydedilmiútir. Her bir fazda enzimatik aktivite ve protein miktarÕ tayinleri yapÕlmÕútÕr. Sulu ikili faz sistemi parametrelerinin analizi için tüm denemeler oda sÕcaklÕ÷Õnda (25±2oC’de) çift çalÕúÕlmÕútÕr. Sulu ikili faz sisteminin optimizasyonunda kullanÕlan koúullar sonuçlar ve tartÕúma bölümünde detaylÕ olarak açÕklanmÕútÕr. 3.5.2 Da÷Õlma parametrelerinin belirlenmesi Hedef biyomolekülün etkili bir ayrÕmÕnÕn yapÕlabilmesi için fazlar arasÕndaki da÷ÕlÕm davranÕúlarÕ aúa÷Õdaki parametrelerin de÷erlendirilmesi ile mümkündür: Faz hacim oranÕ (VR); üst fazdaki hacmin (VÜst) alt fazÕn hacmine (VAlt) oranÕdÕr: VR Vüst Valt 88 Proteinlerin da÷ÕlÕm katsayÕsÕ (Kp); sÕrasÕyla üst ve alt fazdaki protein miktarlarÕnÕn oranÕ úeklinde tanÕmlanmaktadÕr: Kp Püst Palt Püst; üst fazdaki protein konsantrasyonunu, Palt; alt fazdaki protein konsantrasyonunu ifade edilmektedir. ønvertaz enziminin da÷ÕlÕm katsayÕsÕ (Ke); sÕrasÕyla üst ve alt fazdaki invertaz enziminin aktivitelerinin oranÕ úeklinde belirtilmektedir: Ke Aüst Aalt Aüst; üst fazdaki invertaz aktivitesini, Aalt; alt fazdaki invertaz aktivitesini sembolize etmektedir. Spesifik aktivite (SA); her bir fazdaki enzimatik aktivitenin (U/ml) yine her fazdaki protein konsantrasyonuna (mg/ml) oranÕ olarak ifade edilir ve U/mg protein olarak gösterilir: SA Bir fazdaki enzimatik aktivite O fazdaki protein konsantrasyonu SaflaútÕrma katsayÕsÕ (PF); ise üst fazdaki spesifik aktivitenin (SA) diyalizatÕn spesifik aktivitesine oranÕ ile hesaplanmaktadÕr ve; PF Üst fazdakiSA DiyalizatÕn SA 89 olarak belirtilmektedir. ønvertaz enziminin geri kazanÕmÕ (% R); üst fazdaki invertazÕn enzimatik aktivitesinin sisteme ilave edilen invertazÕn baúlangÕç aktivitesine oranÕdÕr ve; R (%) Üst fazdaki enzimatik aktivite Sisteme ilave edilen toplam aktivite úeklinde gösterilir. Sulu ikili faz sisteminde üst fazÕn verimi (% Y); aúa÷Õdaki ifade ile hesaplanÕr: Y (%) 100Vüst K e Vüst K e Valt ønvertaz enziminin selektivitesi (Į); ise Ke ve Kp’nin birbirine oranÕdÕr: Selektivite (D ) Ke Kp 90 3.6 Domates Karakterizasyonu (Lycopersicon esculentum) ønvertazÕnÕn 3.6.1 ønvertaz aktivitesine bazÕ parametrelerin etkisi 3.6.1.1 pH etkisi Enzimler protein yapÕsÕndaki moleküller olduklarÕ için katalitik aktiviteleri çevre koúullarÕndan önemli oranda etkilenmektedir. Bunlardan birisi de ortamÕn pH’sÕdÕr. Enzim aktivitesine pH’Õn etkisi genellikle optimum pH e÷rileri çizilerek izlenir. Bu grafik ba÷Õl aktivitenin pH ile de÷iúimini gösterir. pH’nÕn enzim aktivitesine etkisini incelemek için inkübasyon tamponunun pH’sÕ pH 4,0 ve pH 8,0 arasÕnda de÷iútirilerek standart koúullarda aktiviteleri ölçüldü. ønkübasyon karÕúÕmlarÕnÕn içerdi÷i tampon türü ve pH de÷erleri: asetat (pH 4,0-5,5) ve fosfat (pH 6,0-8,0) olarak seçildi. Enzim aktivitesi (% Ba÷Õl Aktivite) ile pH arasÕnda çizilen grafikten enzimin optimum pH de÷eri belirlendi. Her bir pH de÷eri için iki örnek ve bir kör deneme yapÕlmÕútÕr. 3.6.1.2 SÕcaklÕk etkisi Enzimlerin katalitik aktivitesi sÕcaklÕ÷a ba÷ÕmlÕdÕr. Belirli sÕcaklÕk de÷erlerinin üzerinde enzim proteinin denaturasyonundan dolayÕ aktivitede düúme gözlenir. Enzim aktivitesine sÕcaklÕ÷Õn etkisi genellikle optimum sÕcaklÕk e÷risi çizilerek izlenir. Bu grafik ba÷Õl aktivitenin sÕcaklÕk ile de÷iúimini gösterir. Genellikle inkübasyon süresi arttÕkça termal denaturasyon nedeniyle optimum sÕcaklÕk düúer. 91 ønvertaz enziminin aktivitesinin sÕcaklÕ÷a ba÷ÕmlÕlÕ÷ÕnÕ incelemek ve optimum sÕcaklÕ÷Õ belirlemek amacÕyla inkübasyon sÕcaklÕ÷Õ 4-70oC sÕcaklÕk aralÕ÷Õnda de÷iútirilerek (4, 22, 37, 44, 50, 60, 70oC) enzim aktivitesi ölçüldü. Enzim aktivitesi (% Ba÷Õl Aktivite) ile sÕcaklÕk arasÕnda çizilen grafikten enzimin optimum sÕcaklÕk de÷eri belirlendi. Her bir deneme seti çift çalÕúÕldÕ. 3.6.1.3 Substrat konsantrasyonu etkisi Doygunluk substrat konsantrasyonunu ve Km ile Vmax de÷erlerini belirlemek için düzenlenen deney setinde, 0,2 M asetat tamponunda (pH 5,0) hazÕrlanmÕú 2 M stok sükroz çözeltisi kullanÕlarak farklÕ sükroz konsantrasyonlarÕnda (0,01–2 M) enzim aktivitesi tayin edildi. Substrat (Sükroz) konsantrasyonu ile aktivite arasÕnda çizilen grafikten substrat doygunluk konsantrasyonu belirlendi. 1/S ile 1/V arasÕnda çizilen Lineweaver-Burk diyagramÕndan Km ve Vmax de÷erleri hesaplandÕ. Her bir konsantrasyon için iki deneme yapÕldÕ. 3.6.1.4 ønkübasyon süresi ønkübasyon süresinin enzim aktivitelerine etkisini incelemek için düzenlenen deney setinde enzim, 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60 dakika süreyle 37oC’de inkübe edilerek standart koúullarda aktiviteleri ölçüldü. Her bir deney seti çift çalÕúÕldÕ. 92 3.6.1.5 Efektör konsantrasyonunun etkisi Bir enzimin aktivitesi yalnÕzca fiziksel etmenlerden de÷il kimyasal etmenlerden de etkilenmektedir. Bu etkiler aktiviteyi artÕrÕcÕ (aktivasyon) veya düúürücü (inhibisyon) yönde olabilir. NaCl, KCl, MgCl2.6H2O, MgSO4.7H2O, BaCl2.2H2O, CaCl2, MnSO4.H2O, ZnSO4.7H2O, Na2CO3, CuSO4.5H2O, FeCl3.6H2O ve MnCl2.4H2O’ un farklÕ konsantrasyonlarÕ (0,1-1,0-2,5 mM) reaksiyon ortamÕna eklenerek enzim aktiviteleri üzerine etkileri incelendi. FarklÕ konsantrasyonlardaki efektörler 0,2 M, pH 5,0 asetat tamponunda çözülerek örnek tüplerine 0,6 ml ilave edildi. Üzerlerine sÕrasÕyla 0,2 ml 0,5 M sükroz (asetat tamponunda) ve uygun oranda seyreltilmiú enzim preparatÕndan 0,2 ml enzim eklenip 37oC’de 30 dakika inkübe edilerek standart koúullarda aktiviteleri ölçüldü. 3.6.2 KararlÕlÕk testleri Enzim preparatlarÕ özellikle endüstriyel proseslerde kullanÕlacaklarsa en önemli kriterlerden birisi bu preparatlarÕn kararlÕlÕ÷ÕdÕr. Enzimin kararlÕlÕ÷Õndan anlaúÕlan belirli çalÕúma koúullarÕnda enzim aktivitesinin zamana ba÷lÕ olarak korunmasÕdÕr. Bu sÕradaki enzim aktivite kaybÕ çeúitli nedenlere dayanÕr. Bunlar, mikrobiyal yÕkÕm ve termik, pH veya kimyasal inaktivasyon olarak sÕralanabilir. Domatesten saflaútÕrÕlan invertaz enziminin kararlÕlÕ÷ÕnÕ belirlemek için termal, pH ve depolama kararlÕlÕklarÕ incelenmiútir. 93 3.6.2.1 Termal kararlÕlÕk Enzimler protein yapÕda olduklarÕ ve ÕsÕya karúÕ kararlÕ olmadÕklarÕndan, sÕcaklÕk yükseldikçe inkübasyon süresine ba÷ÕmlÕ olarak aktivite kaybÕ hÕzlanÕr. SÕcaklÕk sabit tutulsa bile yalnÕz inkübasyon süresinin uzamasÕ bile denaturasyon sonucu aktivite kaybÕna neden olur. Termal kararlÕlÕk tayininde, ayni miktarda protein içeren enzimler önce 30 dakika boyunca farklÕ sÕcaklÕklarda (4, 22, 37, 44, 50, 60, 70oC) inkübe edildikten sonra standart aktivite ölçüm koúullarÕnda (37oC’de) aktivite tayinleri yapÕldÕ. Her bir sÕcaklÕk için örnekler çift çalÕúÕlmÕútÕr. 3.6.2.2 pH kararlÕlÕ÷Õ OrtamÕn pH’sÕnÕn enzim aktivite ve kararlÕlÕ÷Õna etkisini incelemek amacÕyla düzenlenen deney setinde enzim, farklÕ pH’daki tamponlarda (asetat: 4,0; 4,5; 5,0; 5,5, fosfat: 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0) 6 saat boyunca 4oC’de bekletildi. ArdÕndan ortamÕn pH’sÕ 5,0’e ayarlanarak standart koúullarda aktiviteleri ölçüldü. Her bir deneme çift çalÕúÕlmÕútÕr. 3.6.2.3 Depo kararlÕlÕ÷Õ Depo kararlÕlÕ÷Õ, enzim uygulamalarÕnÕ ilgilendiren önemli bir parametre olup uzun süre saklama durumunda enzimin aktivite kaybÕnÕn bir ölçüsüdür. Depo kararlÕlÕ÷ÕnÕ belirlemek için 4 oC’de saklanan enzimden 2 ay boyunca belirli zaman aralÕklarÕnda örnekler alÕnarak aktiviteleri optimum koúullarda tayin edildi. 94 4. SONUÇLAR VE TARTIùMA 4.1 ønvertazÕn Domatesten øzolasyonu ve KÕsmi SaflaútÕrÕlmasÕ (Lycopersicon esculentum) ønvertaz enziminin çok çeúitli uygulama alanlarÕndan dolayÕ, bu enzimin farklÕ kaynaklardan izolasyonu ve saflaútÕrÕlmasÕ son yÕllarda oldukça büyük önem kazanmÕútÕr. Enzim; bitkisel (Benkeblia et al., 2004; Fotopoulos, 2005; Lopez et al., 1988; Ishikawa et al., 1989; Nakagawa et al., 1971; Schaffer, 1986; Krishnan et al., 1985; Singh and Knox, 1984; Masuda and Sugawara, 1980; Lee and Sturm, 1996; Moriguchi et al., 1991; Tang et al., 1996; Weil and Rausch, 1990; Obenland et al., 1993; Miller and Ranwala, 1994; Batta et al., 1991; Rojo et al., 1998; Asthir and Singh, 1997; Weersaooriya and Yatawara, 2002; Hashizume et al., 2003; Abdou, 2004; Liu et al., 2006) ve mikrobiyal (Ettalibi and Baratti, 1987; De Rezende and Felix, 1999; Duan et al., 1993; Neumann and Lampen, 1967; Ishimoto and Nakamura, 1997; Meachum et al., 1971; Boddy et al., 1993; Ferreira et al., 1991; Moreno et al., 1990; Chen et al., 1996; Quiroga et al., 1995; De Gines et al., 2000; Liebl et al., 1998; Chavez et al., 1997; De la Vega et al., 1991; De Aguiar Oliveira and Park, 1995; Rubio and Maldonado, 1995; Nadkarni et al., 1993; Belcarz et al., 2002; Ait-Abdelkader et al., 2000; Ghosh et al., 2001; Warchol et al., 2002; Nguyen et al., 2005) kaynaklardan bilinen izolasyon ve saflaútÕrma teknikleri kullanÕlarak izole edilip saflaútÕrÕlmÕú ve karakterizasyonu yapÕlarak uygulamaya sunulmuútur. ønvertaz, úeker endüstrisinde (SaldamlÕ, 2005), karbohidrat yapÕ çalÕúmalarÕ ile biyolojik fonksiyonlarÕn belirlenmesinde (Frevert and Ballou, 1982; Gómez and Villalonga, 2000; Kern et al., 1992; Zeng and Biemann, 1999), immobilizasyon çalÕúmalarÕnda (Tomotani and Vitolo, 2006; Bayramo÷lu 95 et al., 2002; Sanjay and Sugunan, 2004; Bagal and Karve, 2005; Gürsel et al., 2003), transglikozilasyon reaksiyonlarÕnda (Rubio et al., 2002; Nguyen et al., 2004; L’Hocine et al., 2000; Yanahira et al., 1998) ve hayvanlar ile insanlarda intestinal sistemde konstipasyon sorununun giderilmesini sa÷layan oligosakkaritlerin sentezi gibi enzimatik sentezlerde (Nguyen et al., 2005; Hidaka et al., 1987) önemli uygulama alanlarÕ bulmuú bir enzimdir. Her ne kadar oldukça yüksek saflÕkta ve hemen hemen tamamen homojen bir invertaz preparatÕnÕn hazÕrlanabildi÷i çok az sayÕda çalÕúma mevcut ise de, önemli olan daha sonraki çalÕúmalarda kullanÕlabilecek amaca uygun bir protein preparatÕnÕn hazÕrlanmasÕdÕr. ønvertazlar genellikle hücre içerisinde ve di÷er çeúitli glikozidazlarla bir arada bulunurlar. Bu nedenle ço÷u kez bu aktiviteleri birbirinden ayÕrmak oldukça zor olmaktadÕr. E÷er hazÕrlanan enzim preparatÕ di÷er glikozidazlarca kontamine edilmiyor ve geniú bir aglikon spesifikli÷ine sahip ise yukarÕda belirtilen bir çok kullanÕm alanÕ için uygun olacaktÕr. Bu çalÕúmada, enzim kayna÷Õ olarak domates (Lycopersicon esculentum) seçilmiútir. ønvertaz enzimini içeren farklÕ bitkisel kaynaklar (domates, karpuz, kavun, havuç, elma, armut, üzüm, turp, patates, soya filizi) protein miktarlarÕ, aktivite ve spesifik aktivite de÷erleri açÕsÕndan kÕyaslanmÕútÕr. Enzim kayna÷Õ tarama çalÕúmasÕ sonucunda, domatesin di÷er enzim kaynaklarÕna göre dikkate de÷er oranda daha yüksek bir invertaz aktivitesine sahip olmasÕ ve di÷er pek çok kaynakta mevcut úeker oranÕnÕn domatese kÕyasla oldukça yüksek olmasÕ ve bu nedenle de özellikle aktivite tayin aúamalarÕnda giriúime sebep olmalarÕ nedeniyle sulu ikili faz sistemi ile invertaz enziminin saflaútÕrÕlmasÕnda domatesin daha uygun bir kaynak olaca÷Õna karar verilmiútir. AyrÕca domates, ülkemizde her mevsim kolaylÕkla temin edilebilen, ucuz ve bol bulunan bir kaynak olmasÕ, invertaz aktivitesinin bu kaynakta yüksek oranda 96 bulunmasÕ ve güneú altÕnda yetiúen domatesteki enzimlerin termal kararlÕlÕ÷ÕnÕn genellikle yüksek olmasÕndan dolayÕ da tercih edilmiútir. Enzim, “Materyal ve Metod” bölümünde açÕklandÕ÷Õ gibi bilinen genel yöntemler kullanÕlarak domatesten izole edilip, çalÕúmanÕn amacÕna yönelik uygun kÕsmi saf preparat hazÕrlanmÕútÕr. ÇalÕúmada kullanÕlan invertaz preparatÕnÕn protein içeri÷i, aktivite ve spesifik aktivite de÷erleri ilgili bölümlerde ve çizelgelerde verilmiútir. Domates homojenatÕndan (0,177 mg protein/ml, 22 U/mg protein) yola çÕkarak sÕrasÕyla % 85’lik amonyum sülfat çöktürmesi (2,17±0,08 mg protein/ml, 56±5 U/mg protein), sulu ikili faz sistemi (% 15 PEG– 3000 / % 12 Na2SO4 / pH 4,5 / % 5 KCl / 1,25 ml enzim) (0,0812 mg protein/ml, 377 U/mg protein) ve ultrafiltrasyon (0,291 mg protein/ml, 677 U/mg protein) ile enzim homojenata kÕyasla 31 kat saflaútÕrÕlmÕútÕr. ønvertazÕn saflÕ÷ÕnÕn kontrolü ve molekül kütlesi tayini % 10’luk SDSPAGE ile gerçekleútirilmiútir. Elektroforez sonrasÕ jel, Coomasie Brilliant-Blue metodu ile boyanmÕútÕr. Enzimin saflÕ÷ÕnÕn kontrolü ve molekül kütlesinin tayini için yapÕlan elektroforez sonucu ùekil 4.1’de verilmiútir. Elektroforegramdan görüldü÷ü gibi, domatesten izole edilerek hazÕrlanan enzim preparatÕ oldukça homojen bir band vermektedir. Domates invertazÕnÕn molekül kütlesi Vilber Lournat ønfinity Capt Software Ver. 12,8 programÕ ile 19,53 kDa olarak hesaplanmÕútÕr. 97 ùekil 4.1 Domates invertazÕnÕn SDS-Poliakrilamid jel elektroforezi A-B) ATPS sonrasÕ invertaz enzim preparatÕ (a; 15 ȝL ve b; 25 ȝL örnek uygulanmÕútÕr) C) % 85’lik amonyum sülfat çöktürmesi sonrasÕ enzim diyalizatÕ (20 ȝL örnek uygulanmÕútÕr) D) Sigma Moleküler kütle standartlarÕ (SÕ÷Õr albumini; 66 kDa, yumurta albumini; 45 kDa; tavúan kasÕ G–3-P DH enzimi; 36 kDa, sÕ÷Õr karbonik anhidrazÕ; 29 kDa, sÕ÷Õr pankreas tripsinojen; 24 kDa, soya fasulyesi tripsin; 20 kDa, sÕ÷Õr sütü Į-lactalbumini; 14 kDa) 98 ønvertazlarÕn moleküler kütleleri ve yapÕlarÕ kaynaktan kayna÷a ve kullanÕlan tayin yöntemine ba÷lÕ olarak farklÕlÕk göstermektedir. Örne÷in; mango invertazÕnÕn molekül kütlesi jel filtrasyon kromatografisi ile 68 kDa, SDS-PAGE ile 65,5 kDa olarak bulunmuútur (Rahman et al., 2001). ùeker kamÕúÕ invertazÕnÕn molekül kütlesinin SDS-PAGE ile 28 kDa oldu÷u belirtilmiútir (Masuda and Sugawara, 1980). Woodfordia fruticosa invertazÕnÕn molekül kütlesi jel filtrasyonu ile 280 kDa olarak bulunmuú ve enzimin SDS-PAGE ile 66 kDa, 43 kDa ve 40 kDa molekül kütlesine sahip heterotrimerik bir protein oldu÷u belirlenmiútir (Weersaooriya and Yatawara, 2002). ùeker kamÕúÕ nötral invertazÕnÕn 60 kDa molekül kütlesine sahip monomeri oldu÷u ve monomer, dimer ve tetramer olarak katalitik aktivite gösterdi÷i tespit edilmiútir (Vorster and Botha, 1998). Fusarium oxysporum invertazÕnÕn invertaz P-1 ve invertaz P-2 olarak adlandÕrÕlan iki formu bulundu÷u ve bu iki enzimin SDSPAGE ile molekül kütlelerinin sÕrasÕyla 108 kDa ve 84 kDa oldu÷u belirlenmiútir (Nishizawa et al., 1980). Ricinus communis ’dan saflaútÕrÕlan invertazÕn ise homoheptamerik bir protein olup her bir alt birimin 11 kDa oldu÷u SDS-PAGE ile belirlenirken, jel filtrasyonu ile enzimin molekül kütlesi 78 kDa olarak belirlenmiútir (Prado et al., 1985). Havuç invertazÕnÕn alkali invertaz ve nötral invertaz olmak üzere iki formu vardÕr. Alkali invertazÕ homotetramerik bir protein olup her bir alt birimin 126 kDa’luk oldu÷u SDS-PAGE ile belirlenmiú, jel fitrasyonu ile enzimin 504 kDa molekül kütlesine sahip oldu÷u belirtilmiútir. Nötral invertazÕ ise homooktamerik bir protein olup her bir alt birimin 57 kDa oldu÷u SDS-PAGE ile belirlenmiú ve jel filtrasyonu ile enzimin 464 kDa molekül kütlesine sahip oldu÷u bulunmuútur (Lee and Sturm, 1996). Pseudomonas fluorescens invertazÕnÕn SDS-PAGE ile yapÕlan analiz sonucu biri 19 kDa ve di÷eri 21 kDa olan iki tane protein bandÕ görülmüútür (Bugbee, 1984). Equisetum giganteum L invertazÕ homopentamerik bir protein olup 18 kDa’luk her bir alt birim 91 kDa 99 molekül kütlesine sahip enzimi oluúturmaktadÕr (Leal et al., 1999). Domates invertazÕnÕn molekül kütlesi, bitkisel kaynaklÕ di÷er invertazlarla ilgili literatür verileri ile uyum içerisindedir. Genellikle bitkisel kaynaklÕ invertazlarÕn molekül kütlesi 11–100 kDa arasÕnda de÷iúmektedir (bakÕnÕz Çizelge 1.2). 4.2 Sulu økili Faz Sistemi (ATPS) øle Domates (Lycopersicon esculentum) ønvertazÕnÕn SaflaútÕrÕlmasÕ Domatesten izole edilerek amonyumsülfat çöktürmesi ile deriútirilen invertaz enziminin (2,17 mg protein/ml; 56,5 U/mg) saflaútÕrÕlmasÕnda sulu ikili faz sistemlerinden polimer-tuz sistemi kullanÕlmÕútÕr. Bu amaçla, polimer olarak polietilenglikol (PEG) ve tuz olarak farklÕ sülfat tuzlarÕ tercih edilmiútir. ATPS’de faz oluúturan bileúenlerin seçimi en önemli noktalardan birisidir. Bu sistemlerde moleküllerin fazlar arasÕndaki da÷ÕlÕm davranÕúlarÕ hidrofobik etkileúimler, hidrojen ba÷larÕ, yük, sterik etkiler ve biyomoleküllerin özellikleri gibi çeúitli faktörlerden dolayÕ oldukça kompleks bir olaydÕr. Bir baúka ifadeyle, uygun sistemlerin seçimi ve dizaynÕna yol gösterecek kapsamlÕ ve mekanistik bir teori mevcut de÷ildir. Bu yüzden, bu metodun uygulamalarÕnda biyomoleküllerin optimum da÷ÕlÕmÕnÕ sa÷layan en uygun ve iyi bir sistemin hazÕrlanabilmesi için deneysel optimizasyon çalÕúmalarÕna ihtiyaç duyulur. Bu çalÕúmada, tercih edilen sulu ikili faz sistemleri (PEG-Tuz) yüksek seçimlilik, düúük maliyet ve düúük viskoziteden dolayÕ birçok sisteme kÕyasla daha avantajlÕ sistemlerdir. ATPS’de faz oluúturucu polimer olarak PEG’in seçilmesindeki ana kriter; düúük maliyet ve dengeye çok hÕzlÕ ulaúmasÕdÕr. Bu sistemlerde di÷er önemli bir bileúen tuzdur. ATPS sistemlerinin oluúturulmasÕnda farklÕ türde tuzlar (fosfat, sitrat, sülfat gibi) kullanÕlabilmektedir. Bu 100 çalÕúmada, polimer-tuz sistemlerinin hazÕrlanmasÕnda sÕklÕkla kullanÕlan tuzlardan birisi olan sülfat tuzlarÕ tercih edilmiútir. ønvertaz enziminin saflaútÕrÕlmasÕnda kullanÕlacak ikili sulu faz sistemini (PEG-sülfat) optimize etmek ve böylece enzimi iyi bir verimle yüksek oranda saflaútÕrmak için sistemi etkileyen temel parametreler (PEG molekül kütlesi ve konsantrasyonu, tuz türü ve konsantrasyonu, pH, kosolut varlÕ÷Õ, türü ve konsantrasyonu) incelenmiútir. 10 ml’lik sulu ikili faz sistemi, 15 ml’lik dereceli santrifüj tüpleri kullanÕlarak uygun tür ve konsantrasyonlardaki PEG ve tuzlar ile bölüm 3.5.1’de açÕklandÕ÷Õ gibi hazÕrlanmÕútÕr. 4.2.1 Tuz türünün belirlenmesi PEG–2000 ve çeúitli sülfat tuzlarÕnÕn [(NH4)2SO4, MgSO4 ve Na2SO4] farklÕ konsantrasyonlarÕ ile hazÕrlanan sulu ikili faz sistemlerinde domates invertazÕnÕn da÷ÕlÕmÕ gerçekleútirilmiú ve sonuçlar Çizelge 4.1’de verilmiútir. Çizelge 4.1’den görüldü÷ü gibi domates invertazÕ yukarÕdaki faz kompozisyonlarÕnÕn ço÷unda da÷Õlabilmektedir. Faz ayrÕmÕndan sonra iki faz oluúur; PEG’ce zengin üst faz ile tuzca zengin alt faz. Sulu ikili faz sistemleri çalÕúmalarÕnda invertaz enzimi ço÷unlukla seçimli bir úekilde PEG’ce zengin üst faza da÷ÕlmaktadÕr. ønvertazÕn alt fazdan geri kazanÕmÕ oldukça düúüktür. Genellikle, negatif yüklü proteinler PEG/Tuz sistemlerinde üst faza, pozitif yüklü proteinler ise alt faza seçimli olarak da÷ÕlmaktadÕr (Isable and Otero, 2003). Bu nedenle üst faza da÷Õlan invertaz enziminin negatif yüklü olmasÕ muhtemeldir. En yüksek spesifik aktivite (SAüst) ve saflaútÕrma faktörü (PF) de÷erleri Na2SO4 tuzu ile 101 hazÕrlanan sistemlerden elde edilmiútir. (NH4)2SO4 ve MgSO4 varlÕ÷Õnda invertaz enzim aktivitesi azalmaktadÕr. AyrÕca Na2SO4 tuzu, (NH4)2SO4 ve MgSO4 tuzlarÕna göre daha kolay faz oluúturmasÕnÕn yanÕnda proteinler arasÕndaki hidrofobik etkileúimleri çok daha fazla arttÕrma yetene÷ine sahip oldu÷undan invertaz enzimini daha kuvvetli bir úekilde PEG fazÕna yönlendirmektedir (Silva et al., 2007; Yue et al., 2007). PEG/Na2SO4 sistemi invertaz enziminin ço÷unu üst faza yönlendirdi÷inden enzimin sulu ikili faz sisteminde da÷ÕlÕmÕ hidrofobisite ile etkilenmektedir. Fazlar arasÕndaki hidrofobik farkÕn arttÕrÕlmasÕ PEG ve protein molekülleri arasÕndaki hidrofobik etkileúimlerin olma olasÕlÕ÷ÕnÕ daha da arttÕraca÷Õndan daha iyi bir saflaútÕrmaya neden olacaktÕr. Bu nedenle daha sonraki çalÕúmalarda tuz olarak Na2SO4 kullanÕlarak PEG / Na2SO4 sistemi hazÕrlanmÕútÕr. Sülfat tuzlarÕ proteinler arasÕndaki hidrofobik etkileúimleri destekleme yetene÷ine sahip olmasÕ ve ayrÕca proteinlerin yüzeyinden tercihen uzaklaútÕrmasÕ nedeniyle tercih edilmektedir (Su and Chiang, 2006). % 15 PEG–2000 ve % 15 Na2SO4 faz sistemi en yüksek saflaútÕrma (3,3 kat) ve geri kazanÕm (% 152) de÷erlerini vermektedir. Sistem en yüksek Kp de÷erine sahip olmasÕna ra÷men fazlarÕn ayrÕldÕ÷Õ kesitte protein çökelmesi meydana gelmektedir. Bu nedenle invertaz enziminin da÷ÕlÕmÕna PEG molekül kütlesinin etkisinin incelenmesinde protein çökelme olasÕlÕ÷ÕnÕ minimumda tutmak için % 12,5 PEG (2000) / % 12,5 Na2SO4 ile hazÕrlanan sistem kullanÕlmÕútÕr. 102 Çizelge 4.1 ønvertaz enziminin da÷ÕlÕmÕna faz bileúimi ve tuz türünün etkisi. Faz Kompozisyonu (%, w/w) VR SAüst SAalt Kp PF R (%) % 10 PEG–2000 + % 10 (NH4) 2SO4* -- -- -- -- -- -- % 10 PEG–2000 + % 15 (NH4) 2SO4 0,3 27 0,13 0,31 0,48 11,6 % 15 PEG–2000 + % 10 (NH4)2SO4* -- -- -- -- -- -- % 15 PEG–2000 + % 15 (NH4) 2SO4 0,56 29 0,11 0,5 0,53 18 % 10 PEG–2000 + % 10 MgSO4* -- -- -- -- -- -- % 10 PEG–2000 + % 15 MgSO4 2,3 42 11 1,14 0,74 62 % 15 PEG–2000 + % 10 MgSO4* -- -- -- -- -- -- % 15 PEG–2000 + % 15 MgSO4 1,63 29 10 0,79 0,53 0,18 % 10 PEG–2000 + % 10 Na2SO4 0,3 38 91 0,28 0,68 13,3 % 10 PEG–2000 + % 15 Na2SO4 0,72 36 12 1,15 0,64 24 % 15 PEG–2000 + % 10 Na2SO4 1,5 74 35 1,31 1,32 76 % 15 PEG–2000 + % 15 Na2SO4 0,67 185 10 1,87 3,3 152 * Bu faz kompozisyonlarÕnda faz oluúumu gözlenmemiútir. 103 4.2.2 PEG molekül kütlesinin belirlenmesi Sulu ikili faz sistemleriyle gerçekleútirilen ekstraksiyonlarda seçimli bir úekilde saflaútÕrma sa÷layan optimum sistemi bulmak hedeflenir. Bundan dolayÕ sulu ikili faz sisteminin optimizasyonunda en uygun polimer molekül kütlesinin seçimi anahtar noktalardan bir tanesidir. Polimer molekül kütlesi materyalin da÷ÕlÕmÕnda önemlidir: Ya faz diyagramÕnÕ de÷iútirerek (örne÷in faz bileúimine etki ederek) yada polimer-enzim etkileúimlerinin sayÕsÕnÕ de÷iútirerek materyalin fazlara da÷ÕlÕmÕnÕ etkiler (Antov et al., 2006). PEG molekül kütlesinin faz hacimlerinin oranÕna (VR), enzimin da÷Õlma katsayÕsÕna (Ke), proteinlerin da÷Õlma katsayÕsÕna (Kp), saflaútÕrma katsayÕsÕ ve enzimin geri kazanÕmÕna etkisi % 12,5 PEG / % 12,5 Na2SO4 sistemi kullanÕlarak incelenmiú ve sonuçlar Çizelge 4.2’de verilmiútir. Çizelge 4.2 ønvertaz enziminin da÷ÕlÕmÕna PEG molekül kütlesinin etkisi. PEG MW VR Ke Kp PF R (%) 1000 0,43 0,35 0,76 0,62 25,8 2000 0,43 0,16 0,51 0,45 13,8 3000 0,45 1,11 0,42 2,37 68,2 4000 0,41 0,51 0,42 1,39 37,9 6000 0,33 0,62 0,27 2,05 38,7 8000 0,33 0,15 0,23 0,55 9,25 ønvertaz enziminin PEG/Na2SO4 sisteminde da÷ÕlÕmÕ PEG’in molekül kütlesine ba÷lÕdÕr. Bu özellik genelde PEG’in zincirleri ve 104 biyomateryalin hidrofobik alanÕ arasÕndaki hidrofobik etkileúimlere dayandÕrÕlmaktadÕr. Genellikle PEG molekül kütlesinin artmasÕ ile ekstraksiyon verimi azalmaktadÕr. Yüksek molekül kütlelerinde PEG ve protein domaini arasÕndaki etkileúim düúmektedir ve bunun sonucunda Ke düúmektedir. Bunun sebeplerinden bir tanesi polimerin molekül a÷ÕrlÕ÷Õndaki artÕúÕn polimerin dÕúlama etkisini yükseltmesidir. Bunun sonucunda polimer kendi içerisinde oluúturdu÷u intramoleküler hidrofobik etkileúimler ile daha sÕkÕ bir konformasyon kazanÕr ve bu yüzden biyomolekülün üst faza da÷ÕlÕmÕnÕ engeller. Buda yüksek viskozite ve düúük tekrarlanabilirlik ile sonuçlanÕr (Mohamadi et al., 2007). Düúük molekül a÷ÕrlÕ÷Õna sahip polimerlerde dÕúlama etkisi azalaca÷Õndan istenilen protein yanÕnda istenmeyen proteinler de üst faza geçecek ve elveriúli bir ayrÕm gerçekleútirmek için yetersiz kalacaktÕr (Cascone et al., 1991). Bu yüzden genellikle orta seviyede molekül kütlesine sahip PEG türleri sulu ikili faz sistemi için en iyi seçim olacaktÕr (Su and Chiang, 2006). Çizelge 4.2’den görüldü÷ü gibi dengeden sonra sistemdeki faz hacim oranlarÕ (VR) 0.45-0.33 arasÕnda çok az de÷iúmektedir. Bu nedenle da÷Õlma parametrelerindeki farklanmanÕn PEG molekülünün boyutuna ba÷lÕ oldu÷u açÕktÕr. ùekil 4.2’den görüldü÷ü gibi PEG molekül kütlesinin PEG-1000’den PEG-8000’e artmasÕ ile polimerin dÕúlama etkisi de arttÕ÷Õndan proteinlerin da÷Õlma katsayÕsÕ (Kp) giderek azalmaktadÕr. PEG–1000 düúük molekül a÷ÕrlÕ÷Õna sahip oldu÷undan ve dÕúlama etkisi di÷er PEG molekül a÷ÕrlÕklarÕna daha göre az oldu÷undan istenilen protein yanÕnda istenmeyen proteinleri de üst faza çekmektedir ve bu yüzden de en yüksek Kp de÷erine sahiptir. Pek çok protein için benzer davranÕúa çeúitli PEG/Dekstran ve PEG/Tuz sistemlerinde rastlanmaktadÕr (Engel et al., 2000; Albertsson et al., 1990; Schmidt et al., 1994). 105 0,8 0,7 0,6 Kp 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 1000 2000 3000 4000 6000 8000 Protein da÷Õlma 0,76 0,51 0,42 0,42 0,27 0,23 katsayÕsÕ (Kp) PEG molekül kütlesi ùekil 4.2 % 12,5 PEG / % 12,5 Na2SO4 sisteminde PEG molekül kütlesinin protein da÷Õlma katsayÕsÕna (Kp) etkisi ùekil 4.3’den görüldü÷ü gibi, PEG’in molekül kütlesi artÕkça hidrofobik karakteri de artmakta ve invertaz enzimi daha seçimli da÷ÕlmaktadÕr. PEG molekül a÷ÕrlÕ÷Õ 1000’den 3000’e arttÕ÷Õnda enzimin da÷Õlma katsayÕsÕ (Ke) yaklaúÕk 3,1 kat artmaktadÕr ve PEG–3000 molekül a÷ÕrlÕ÷Õnda en yüksek saflaútÕrma katsayÕsÕ (2,37 kat) ve geri kazanÕm de÷erine (% 68,2) ulaúÕlmaktadÕr. PEG–6000 de yüksek bir saflaútÕrma katsayÕsÕ (2,05 kat) göstermektedir. Ancak, PEG-4000’den itibaren ortamÕn viskozlu÷u artmaktadÕr. PEG 3000, 4000 ve 6000’de en yüksek Ke de÷erlerine ulaúÕlmÕútÕr ve bu sonuçlar di÷er literatürlerle benzerlik göstermektedir (He et al., 2005; Mohamadi et al., 2007; Engel et al., 2000). PEG–8000 ise, çok yüksek molekül a÷ÕrlÕklarda karúÕlaúÕlan dÕúlama etkisi ile invertaz enziminin üst faza yönelimini engellenmektedir (Mohamadi et al., 2007; Engel et al., 2000). PEG molekül kütlesinin enzimin da÷Õlma katsayÕsÕna (Ke), proteinlerin 106 da÷Õlma katsayÕsÕna (Kp), saflaútÕrma katsayÕsÕ(PF) ve enzimin geri kazanÕmÕna etkisi kÕyaslandÕ÷Õnda PEG–3000’in sistem için uygun polimer molekül kütlesi oldu÷una karar verilmiútir. 1,2 1 Ke 0,8 0,6 0,4 0,2 0 ønvertaz enziminin da÷Õlma katsayÕsÕ (Ke) 1000 2000 3000 4000 6000 8000 0,35 0,16 1,11 0,51 0,62 0,15 PEG molekül kütlesi ùekil 4.3 % 12,5 PEG / % 12,5 Na2SO4 sisteminde PEG molekül kütlesinin invertaz enziminin da÷Õlma katsayÕsÕna (Ke) etkisi 4.2.3 PEG (3000) konsantrasyonunun belirlenmesi ønvertaz enziminin PEG/Na2SO4 sisteminde da÷ÕlÕmÕna PEG konsantrasyonunun etkisini incelemek amacÕyla PEG’in farklÕ konsantrasyonlarÕ (% 10-20) ve % 12,5 Na2SO4 kullanÕlmÕú ve sonuçlar ùekil 4.4’de gösterilmiútir. 107 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 10 12,5 15 17,5 20 SaflaútÕrma KatsayÕsÕ 0,54 2,37 2,66 1,31 1,68 Protein da÷Õlma katsayÕsÕ (Kp) 0,3 0,42 0,63 0,8 0,86 Verim (%) 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 4 33 67,5 55 81 PEG-3000 Konsantrasyonu (%, w/w) ùekil 4.4 PEG-3000 konsantrasyonunun PEG/Na2SO4 sisteminde invertaz ekstraksiyonuna ve da÷ÕlÕmÕna etkisi Genellikle polimer konsantrasyonun artmasÕ ile fazlar arasÕnda hidrofobik fark artacaktÕr. Bunun sonucunda protein ve PEG molekülleri arasÕndaki hidrofobik etkileúimler artacak ve proteinler üst faza do÷ru yönelecektir (Vaidya et al., 2006). ùekil 4.4’den görüldü÷ü gibi polimer konsantrasyonun artmasÕ ile alt fazda bulunan proteinler üst faza do÷ru yönelmektedirler. PEG konsantrasyonundaki bu artÕú ile Kp de÷erleri 0,3’den 0,86’ya ve verim ise % 4’ten % 81’ye kadar çÕkmaktadÕr. Polimer konsantrasyonu invertaz enziminin da÷ÕlÕmÕnda çok etkilidir. Ancak % 20 PEG–3000 konsantrasyonunda % 81’lik bir verim elde edilmesine ra÷men üst fazda invertaz enzimi yanÕnda istenmeyen di÷er proteinlerde bulundu÷undan çok iyi bir saflaútÕrma gerçekleútirilememektedir. Fakat invertaz enzimi polimer (PEG–3000) 108 konsantrasyonu arttÕkça özellikle % 10’dan % 15’e geçildi÷inde üst faza yaklaúÕk 27,2 kat daha seçimli bir da÷ÕlÕm göstermekte (ùekil 4.5) ve en yüksek saflaútÕrma katsayÕsÕna (2,66 kat) sahip olmaktadÕr. Bu nedenle en uygun PEG konsantrasyonu saflaútÕrma katsayÕsÕ açÕsÕndan % 15 olarak seçilmiútir. 6 5 Ke 4 3 2 1 0 ønvertaz da÷Õlma katsayÕsÕ (Ke) 10 12,5 15 17,5 20 0,13 1,11 3,54 1,83 5,46 PEG-3000 Konsantrasyonu (% ,w/w) ùekil 4.5 PEG-3000 konsantrasyonunun PEG-Na2SO4 sisteminde invertaz da÷Õlma katsayÕsÕna (Ke) etkisi 4.2.4 Na2SO4 konsantrasyonunun belirlenmesi ønvertaz enziminin PEG/Na2SO4 sisteminde da÷ÕlÕmÕna tuz konsantrasyonunun etkisini incelemek için tuzun farklÕ konsantrasyonlarÕ (% 10–16) ve % 15 PEG-3000 kullanÕlmÕú ve sonuçlar ùekil 4.6’ da verilmiútir. 160 3 140 2,5 120 PF 3,5 100 2 80 1,5 60 1 40 0,5 20 0 10 11 11,5 12 12,5 13 14 15 16 G eri k a za n Õm (% ) 109 0 SaflaútÕrma katsayÕsÕ 0,47 1,41 2,74 3,33 2,66 2,25 1,82 1,88 1,3 (PF) Geri kazanÕm (%) 16,7 53,2 106 134 116 110 94 97 70 Na2SO4Konsantrasyonu(%, w/w) ùekil 4.6 Na2SO4 konsantrasyonunun PEG/Na2SO4 sisteminde invertaz ekstraksiyonuna ve da÷ÕlÕmÕna etkisi Sulu ikili faz sistemlerinde tuz konsantrasyonu enzimin yüzey özelliklerini de÷iútirmekden sorumludur. Tuz konsantrasyonun artmasÕ ile proteinler daha hidrofobik olaca÷Õndan da÷ÕlÕmlarÕ üst faza gitme e÷iliminde olacaktÕr. Bununla birlikte tuz konsantrasyonunun artmasÕ ile proteinler üst fazdan geri çevrilmektedir ve proteinlerin aúÕrÕsÕ faz ayrÕmÕnÕn gerçekleúti÷i yerde çökmektedir. AyrÕca, enzimler yüksek tuz konsantrasyonunun “salting-out” etkisi ile denatüre olduklarÕndan aktiviteleri ve geri kazanÕmlarÕ düúmektedir(Vaidya et al., 2006; Klomklao et al., 2005; Yue et al., 2007). Bu nedenle tuz konsantrasyonun belirlenmesi invertaz enziminin da÷ÕlÕmÕ ve geri kazanÕmÕ açÕsÕndan kritiktir. ùekil 4.6’den görülece÷i üzere Na2SO4 110 konsantrasyonu % 10’dan % 12’ye arttÕrÕldÕ÷Õnda saflaútÕrma katsayÕsÕ yaklaúÕk 7,1 kat artarak 0,47’den en yüksek de÷eri olan 3,33’e çÕkmakta, enziminin geri kazanÕmÕ % 134 olmaktadÕr. Tuz konsantrasyonunun % 12’nin üzerine çÕkmasÕ ile enzimin aktivitesi ve geri kazanÕm de÷erleri azalmaktadÕr. AyrÕca % 15–16 gibi yüksek Na2SO4 konsantrasyonunda invertaz enziminin fazlarÕn ayrÕldÕ÷Õ kesitte çöktü÷ü gözlenmiútir. Benzer davranÕúa literatürlerde pek çok enzim için rastlanmÕútÕr (Yue et al., 2007). ùekil 4.7’da görüldü÷ü gibi tuz konsantrasyonun % 10’dan % 16’ya arttÕrÕlmasÕ protein da÷Õlma katsayÕsÕnÕ (Kp) 0,48’den 1,12’ye arttÕrmaktadÕr. Bunun nedeni, tuz konsantrasyonun artmasÕ ile alt fazda bulunan proteinlerin hidrofobisitesinin giderek artmasÕ ve yönelimlerinin hidrofobik üst faza do÷ru olmasÕdÕr. Sonuç olarak, enzimin da÷Õlma katsayÕsÕ (Kp), saflaútÕrma katsayÕsÕ ve geri kazanÕmÕ açÕsÕndan çalÕúmanÕn devamÕnda optimum Na2SO4 konsantrasyonu % 12 olarak seçilmiútir. Kp 1,5 1 0,5 0 10 11 11,5 12 12,5 13 14 15 16 0,48 0,52 0,54 0,56 0,63 0,78 0,96 1,05 1,12 Proteinlerin da÷Õlma katsayÕsÕ (Kp) Na2SO4 konsantrasyonu (%, w/w) ùekil 4.7 % 15 PEG-Na2SO4 sisteminde Na2SO4 konsantrasyonunun protein da÷ÕlÕma katsayÕsÕna (Kp) etkisi 111 4.2.5 pH etkisinin belirlenmesi Sulu ikili faz sisteminde biyomoleküllerin da÷ÕlÕmÕnÕ etkileyen bir baúka önemli faktör sistemin pH’sÕdÕr. Biyomoleküllerin da÷ÕlÕmÕ sistemde bulunan iyonlarÕn türü ve konsantrasyonu ile belirlenmektedir. pH, saflaútÕrÕlmasÕ hedeflenen proteinin ve iyon kompozisyonunun yüküne, kontaminantlarÕn yüzey karakteristi÷ine etki eder ve fazlar arasÕnda da÷ÕlÕmÕn farklÕlaúmasÕna sebep olur (Mohamadi et al., 2007). PEG / Tuz sistemlerinde genellikle asidik izoelektrik noktaya (pI) sahip negatif yüklü proteinlerin büyük bir kÕsmÕ üst faza ve pozitif yüklü proteinler ise alt faza gitmektedir. pH’Õn yükselmesi ile proteinler negatif yüklü hale gelecektir ve beklenildi÷i gibi PEGce zengin üst faz ile proteinler arasÕndaki etkileúimler daha kuvvetli olacak ve proteinlerin da÷Õlma katsayÕsÕ (Kp) büyüyecektir (Albertsson, 1986; Rito-Palomares, 2004; Hatti-Kaul, 1999). PEG/ Na2SO4sisteminde invertaz enziminin da÷ÕlÕmÕna pH’Õn etkisini incelemek için sistemin pH’sÕ 4.5-7.5 arasÕnda de÷iútirilmiú ve sonuçlar ùekil 4.8’de verilmiútir. ùekilden görüldü÷ü gibi, pH 4.5’da enzim % 73 verim ile 4.4 kat saflaútÕrÕlmÕútÕr. Bu pH de÷erinin altÕnda ve üstündeki pH de÷erlerinde saflaútÕrma katsayÕsÕ (PF) farklanÕrken verim hemen hemen hiç de÷iúmemiútir. ùekil 4.9’den görüldü÷ü gibi, invertaz enziminin da÷Õlma katsayÕsÕ (Ke) çok kararsÕzdÕr. Bitkisel kaynaklÕ invertazlarÕn izoenzimlerinin izoelektrik noktasÕ (pI) 4.8–7.4 arasÕnda farklÕlÕk göstermektedir. Bu yüzden sulu ikili faz sistemlerinde sistemin pH’Õ, invertazlarÕn da÷ÕlÕmÕna düzensiz etki etmektedir. Benzer bir durum patates polifenol oksidaz enziminin saflaútÕrÕlmasÕ sÕrasÕnda da görülmektedir (Vaidya et al., 2006). øzoelektrik noktanÕn üstündeki pH de÷erlerinde, iyonik etkileúimler hidrofobik da÷ÕlÕmÕndan üstün gelecek 112 5 PF 4 3 2 1 0 4 4,5 5 5,5 6 6,5 7 7,5 80 70 60 50 40 30 20 10 0 V erim (% ) ve invertaz enzimi üst fazda kalma e÷ilimi gösterecektir. ùekil 4.10’dan görüldü÷ü gibi pH’Õn yükselmesiyle proteinler negatif yüklü hale geçerek PEGce zengin üst faza hareket etmekte ve proteinlerin da÷Õlma katsayÕsÕ (Kp) 0,47’den 0,74’e çÕkmaktadÕr. Sonuç olarak, PEG/ Na2SO4 sulu ikili faz sistemi ile invertazÕn saflaútÕrÕlmasÕnda en uygun pH 4.5 olarak belirlenmiútir. 3,3 4,4 3,3 3,8 3,6 3,1 2,7 1,3 SaflaútÕrma katsayÕsÕ (PF) Verim (%) 69,9 73,4 65 71 70 72 73 60 pH ùekil 4.8 % 15 PEG-% 12 Na2SO4 sisteminde invertaz ekstraksiyonuna ve da÷ÕlÕmÕna pH’Õn etkisi 113 4,5 4 3,5 Ke 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 ønvertaz enziminin da÷Õlma katsayÕsÕ (Ke) 4 4,5 5 5,5 6 6,5 7 7,5 3,5 4,1 3,5 3,7 3,6 3,9 4 2,3 pH ùekil 4.9 % 15 PEG-% 12 Na2SO4 sisteminde pH’Õn invertaz da÷Õlma katsayÕsÕna (Ke) Kp etkisi 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 4 4,5 5 5,5 6 6,5 7 7,5 Protein da÷ÕlÕm 0,47 0,48 0,56 0,58 0,59 0,63 0,68 0,74 katsayÕsÕ (Kp) pH ùekil 4.10 % 15 PEG-% 12 Na2SO4 sisteminde pH’Õn protein da÷Õlma katsayÕsÕna (Kp) etkisi 114 4.2.6 Kosolut tuz türü ve konsantrasyonun belirlenmesi (øyonik úiddetin etkisinin belirlenmesi) etkisinin Sulu ikili faz sistemlerinde tuzlar genellikle proteinlerin da÷ÕlÕmÕnÕ geliútirmek için kullanÕlÕrlar. FarklÕ iyonlar fazlara karúÕ farklÕ ilgi gösterdiklerinden fazlar arasÕnda meydana gelen itici güç sebebiyle iyonlarÕn da÷ÕlÕmÕ düzensiz olacaktÕr. Bu elektrokimyasal itici güç her bir fazdaki elektrostatik potansiyel farkÕn olmasÕndan dolayÕ oluúmaktadÕr. Bu potansiyel fark, iki faz için iyonlarÕn farklÕ afiniteleri tarafÕndan oluúturulmaktadÕr. Sonuçta elektrostatik potansiyel farklanma proteinlerin da÷ÕlÕmÕnÕ etkilemektedir. Sulu ikili faz sistemlerinde iyonlarÕn da÷ÕlÕmÕ Hofmeister serisini takip etmektedir; kaotropik (hidrofobik) karakterdeki iyonlar hidrofobik karakterdeki faza do÷ru da÷ÕlmaktadÕr (Persson et al., 1999b). KCl, NaCl, Na2CO3, MgSO4, MnCl2 ve MgCl2 tuzlarÕ % 15 PEG– 3000 / % 12 Na2SO4 (pH 4,5) sistemlerine çeúitli konsantrasyonlarda ilave edilerek iyonik úiddetin invertaz enziminin da÷ÕlÕmÕna etkisi incelenmiútir. Sisteme ilave edilen kosolut türü ve konsantrasyonuna ba÷lÕ olarak saflaútÕrma katsayÕsÕ ve verinm de÷erlerinin de÷iúimi ùekil 4.11, 4.12, 4.13, 4.14, 4.15, 4.16, 4.17 ve 4.18’de verilmiútir. ùekil 4.17 ve ùekil 4.18’den görüldü÷ü gibi MnCl2 ve MgCl2 tuzlarÕnÕn farklÕ konsantrasyonlarÕ kullanÕlarak hazÕrlanan sistemlerde invertaz enziminin saflaútÕrma katsayÕsÕ (PF) 0,5–1,8 arasÕnda de÷iúmektedir. AyrÕca bu iki tuz ile elde edilen maksimum verim MnCl2 (% 1) için % 63 ve MgCl2 (% 2,5) için % 43 dür. Bu nedenle bu iki tuzun varlÕ÷ÕnÕn enzimin da÷ÕlÕmÕ ve saflaútÕrÕlmasÕna önemli bir etkisi olmamÕútÕr. Benzer bir úekilde NaCl (ùekil 4.14), Na2CO3 (ùekil 4.15) ve 115 MgSO4 (ùekil 4.16) tuzlarÕnÕn sisteme eklenmesi ile enzimin saflaútÕrÕlmasÕnda çok etkili olmadÕ÷Õ görülmüútür. Ancak bu tuzlar ile elde edilen saflaútÕrma katsayÕsÕ ve verimler di÷er iki tuza (MnCl2 ve MgCl2) kÕyasla daha yüksektir. % 1’lik NaCl ile % 75 verimle 3,8 kat, % 1’lik Na2CO3 ile % 69 verimle 3,8 kat ve % 7.5’lik MgSO4 ile % 71 verimle 4,09 katlÕk bir saflaútÕrma sa÷lanmÕútÕr. Benzer sonuçlara literatürde de rastlanmÕútÕr (Yue et al., 2007). ùekil 4.11’de invertazÕn da÷ÕlÕmÕna KCl’ün etkisi gösterilmiútir. Enzim % 5’lik KCl varlÕ÷Õnda % 88 verimle 5.5 kat saflaútÕrÕlmÕútÕr. KCl tuzunun varlÕ÷ÕnÕn enzimin da÷ÕlÕmÕna (Ke) etkisi oldukça belirgin olup (ùekil 4.12) enzimin alt fazdan üst faza do÷ru yönelmesini sa÷lamÕútÕr. Bununla birlikte ùekil 4.12’de sulu ikili faz sisteminde etkili bir saflaútÕrma için önemli bir baúka nokta gözlenmektedir; kontamine proteinler saflaútÕrÕlmasÕ hedeflenen enzimle ayni fazda ekstrakte edilmemelidir. Bu yüzden en iyi sistem en düúük Kp ve en yüksek Ke de÷erlerine sahip olmalÕdÕr. % 15 PEG–3000 / % 12 Na2SO4 / pH 4,5 sistemiyle elde edilen protein da÷Õlma katsayÕsÕ (Kp) % 15 PEG–3000 / % 12 Na2SO4 / pH 4,5 / % 5 KCl sistemi ile 0,48’den 0,35’e düúmekte ve sistemin Ke de÷eri ise 4,1’den 11’e çÕkmaktadÕr. ùekil 4.13, sulu ikili faz sisteminde kosolut olarak KCl tuzunun invertaz enziminin da÷ÕlÕmÕnda ne kadar seçimlilik sa÷ladÕ÷Õ (D=31) ve geri kazanÕm de÷erinin (R; % 154) ne kadar yüksek oldu÷unu göstermektedir. KCl tuzunun bazÕ sulu ikili faz sistemlerinde oldukça seçimli saflaútÕrma yaptÕ÷Õna dair pek çok literatür bulunmaktadÕr (Engel et al., 2000; Franco et al., 1996; Zaslavsky et al., 1988). Özetle, en iyi ve seçimli invertaz da÷ÕlÕmÕ % 15 PEG–3000 / % 12 Na2SO4 / pH 4,5 / % 5 KCl sa÷lanmÕútÕr. 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 6 5 PF 4 3 2 1 0 0,5 1 2,5 5 7,5 SaflaútÕrma katsayÕsÕ (PF) 4,1 5,3 5,1 5,5 2,7 Verim (%) 63 Verim (%) 116 75 79 88 74 KCl konsantrasyonu (%, w/w) 0,6 12 0,5 10 0,4 8 0,3 6 0,2 4 0,1 2 0 0,5 1 2,5 5 7,5 Protein da÷Õlma katsayÕsÕ (Kp) 0,31 0,28 0,33 0,35 0,52 ønvertaz enziminin da÷Õlma katsayÕsÕ (Ke) 2,6 4,5 5,2 11 5,8 Ke Kp ùekil 4.11 Kosolut olarak KCl’ün PEG-Na2SO4 sistemine etkisi 0 KCl konsantrasyonu (%, w/w) ùekil 4.12 Kosolut olarak KCl’ün farklÕ konsantrasyonlarÕnÕn protein da÷Õlma katsayÕsÕna (Kp) ve invertazÕn da÷Õlma katsayÕsÕna (Ke) etkisi 117 35 160 30 150 140 130 20 120 15 110 10 100 5 0 R Selektivite (Į) 25 90 0,5 1 2,5 5 7,5 Selektivite (Į) 8,3 15,8 16 31 11,1 Geri kazanÕm (R, %) 104 125 135 154 KCl konsantrasyonu (%, w/w) 80 98 ùekil 4.13 Kosolut olarak KCl’ün farklÕ konsantrasyonlarÕnÕn selektivite (Į) ve 4 3,5 3 PF 2,5 2 1,5 1 0,5 0 0,5 0,75 1 1,5 2,5 5 SaflaútÕrma katsayÕsÕ (PF) 3,1 2,9 3,8 2,5 2,9 2,9 Verim (%) 66 67 75 60 75 NaCl konsantrasyonu(%, w/w) 88 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 ùekil 4.14 Kosolut olarak NaCl’ün PEG-Na2SO4 sistemine etkisi Verim (%) geri kazanÕma (R) etkisi 80 70 3 60 2,5 50 PF 4 3,5 2 40 1,5 30 1 20 0,5 10 0 0,5 0,75 1 1,5 2,5 5 Verim (%) 2,1 2,5 SaflaútÕrma katsayÕsÕ (PF) 46 50 3,8 2 3,5 2,5 69 52 71 60 Verim(%) 118 0 Na 2CO3 Konsantrasyonu(%, w/w) ùekil 4.15 Kosolut olarak Na2CO3’Õn PEG-Na2SO4 sistemine etkisi PF 4 60 50 3 40 30 20 2 1 0 SaflaútÕrma katsayÕsÕ (PF) Verim (%) 0,5 1 2,5 5 7,5 10 3,49 2,49 2,48 3,5 4,09 4,05 40 10 0 36 42 57 71 62 MgSO4 konsantrasyonu (%, w/w) ùekil 4.16 Kosolut olarak MgSO4’Õn PEG-Na2SO4’Õnsistemine etkisi Verim (%) 80 70 5 119 70 2 PF 50 40 1 30 20 0,5 Verim(%) 60 1,5 10 0 0,5 1 2,5 5 SaflaútÕrma katsayÕsÕ (PF) 0,5 1,83 1,61 0,6 Verim (%) 28 63 52 38 MnCl2 Konsantrasyonu(%, w/w) 0 2 PF 1,5 1 0,5 0 SaflaútÕrma katsayÕsÕ (PF) Verim (%) 0,5 1 2,5 5 1,51 0,54 1,83 1,04 35 10 43 30 MgCl2 Konsantrasyonu(%, w/w) ùekil 4.18 Kosolut olarak MgCl2’ün PEG-Na2SO4 sistemine etkisi 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 Verim (%) ùekil 4.17 Kosolut olarak MnCl2’ün PEG-Na2SO4 sistemine etkisi 120 4.2.7 ønvertaz konsantrasyonunun da÷ÕlÕma etkisi Hedef molekülün ayrÕmÕ ve saflaútÕrÕlmasÕnda ATPS sistemine yüklenen protein miktarÕ özellikle büyük ölçekli prosesler için çok önemlidir (Antov et al., 2006). Protein konsantrasyonu doygunluk sÕnÕrÕna yaklaútÕkça, sistemde doygun hal durumu gözlenir. Protein konsantrasyonunun bu sÕnÕrdan daha yükse÷e arttÕrÕlmasÕ proteinin çökelmesine neden olur ve sonuçta da geri kazanÕm düúük olur. Bu nedenle sulu ikili faz sisteminde protein konsantrasyonu doygunluk sÕnÕrÕnÕn altÕnda olmalÕdÕr. Genellikle her bir gramlÕk sisteme 1 mg protein konsantrasyonu optimaldir (Engel et al., 2000). Domatesten % 85 (NH4) 2SO4 tuz çöktürmesiyle hazÕrlanan invertaz ekstraktÕ (2.17 mg/ml) % 15 PEG–3000 / % 12 Na2SO4 / pH 4,5 / % 5 KCl sistemine farklÕ miktarlarda (0,25-1 ml) ilave edilerek enzim konsantrasyonunun invertaz enziminin da÷ÕlÕmÕna etkisi incelenmiú ve sonuçlar ùekil 4.19 ve ùekil 4.20’da gösterilmiútir. Elde edilen sonuçlara göre, invertaz enzimi ve di÷er proteinlerin konsantrasyonlarÕ da÷ÕlÕma önemli derecede etki etmektedir. % 15 PEG– 3000 / % 12 Na2SO4 / pH 4,5 / % 5 KCl / 0,25 ml enzim sisteminde invertaz enzimi üst faza karúÕ en yüksek Ke ve selektiviteye sahiptir (ùekil 4.19). Ancak saflaútÕrma katsayÕsÕ (4,1 kat) en düúük olandÕr (ùekil 4.20). Enzim konsantrasyonu de÷iútikçe Ke, Kp, D ve PF de÷erleri farklanmaktadÕr. Sisteme yüklenen enzim miktarÕ, hem faz hacim oranÕnÕ hem de faz bileúimini de÷iútirerek enzimlerin da÷ÕlÕmÕna etki eder (Antov et al., 2006). Ancak % 15 PEG–3000 / % 12 Na2SO4 / pH 4,5 / % 5 KCl / 0,5 ml enzim sistemi saflaútÕrma katsayÕsÕ (5,5 kat) ve proteinlerin 121 25 60 20 50 40 15 30 10 20 5 0 Į Ke da÷Õlma katsayÕsÕ (0,35) açÕsÕndan en optimal sonuçlarÕ vermiú oldu÷undan en ideal sistem olarak seçilmiútir (ùekil 4.20). 10 0,25 0,5 0,75 1 ønvertaz enziminin da÷Õlma katsayÕsÕ (Ke) 22 11 14 13 Selektivite (Į) 55 31 33 Enzim miktarÕ (ml) 0 28 ùekil 4.19 % 15 PEG-3000 / % 12 Na2SO4 / pH 4.5 / % 5 KCl sisteminde invertazÕn da÷ÕlÕmÕna (Ke) ve selektivitesine (Į) enzim miktarÕnÕn etkisi 6 5 PF 4 3 2 1 0 0,25 0,5 0,75 1 SaflaútÕrma KatsayÕsÕ (PF) 4,1 5,5 4,5 5,1 Protein da÷Õlma katsayÕsÕ (Kp) 0,4 0,35 0,41 0,46 0,5 0,45 0,4 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 Kp 122 Enzim miktarÕ (ml) ùekil 4.20 % 15 PEG-3000 / % 12 Na2SO4 / pH 4.5 / % 5 KCl sisteminde invertaz saflaútÕrma katsayÕsÕ ve protein da÷Õlma katsayÕsÕna enzim miktarÕnÕn etkisi 4.2.8 Büyük ölçekli sulu ikili faz sistemi Son on yÕldan fazla bir süredir sulu ikili faz sistemleri ile büyük ölçekli sistemlerde protein saflaútÕrÕlmasÕ baúarÕyla gerçekleútirilmektedir. Bu yenili÷in getirmiú oldu÷u en önemli özelliklerden bir tanesi kimya endüstirisinde rutin organik temelli ekstraksiyon yöntemlerinin yerini alabilece÷inin öngörülmesidir ancak faz oluúum ve protein da÷ÕlÕmÕnÕn tam olarak anlaúÕlamamasÕ gibi nedenlerden dolayÕ sulu ikili faz sistemlerinin uygulanabilmesi hala çok sÕnÕrlÕdÕr (Hatti-Kaul, 2000). 123 8 PF 6 4 2 0 10 25 50 SaflaútÕrma KatsayÕsÕ (PF) 5,5 6,7 4,4 Proteinlerin Da÷Õlma KatsayÕsÕ (Kp) 0,36 0,46 0,47 0,5 0,45 0,4 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 Kp PEG molekül kütlesi ve konsantrasyonu, tuz türü ve konsantrasyonu, pH, kosolut türü ve konsantrasyonu, protein miktarÕ gibi koúullarÕn optimize edildi÷i sulu ikili faz sistemi (% 15 PEG–3000 / % 12 Na2SO4 / pH 4,5 / % 5 KCl / 0,5 ml enzim) 10, 25 ve 50 ml’lik sistemlerde hazÕrlanmÕú ve invertaz enziminin saflaútÕrÕlmasÕnda kullanÕlabilecek büyük ölçekli sistemler (25 ve 50 ml’lik) de÷erlendirilmiútir. ùekil 4.21 ve 4.22’den görüldü÷ü gibi 25 ml’lik sistem ile enzim % 90 verim ve % 214 geri kazanÕmla 6.7 kat saflaútÕrÕlmÕútÕr. SaflaútÕrÕlan enzimin spesifik aktivitesi 377 U/mg olarak belirlenmiútir (ùekil 4.23). Sistem hacmi (ml) ùekil 4.21 Büyük ölçekli PEG 3000- Na2SO4 sisteminde invertaz enziminin saflaútÕrma sonuçlarÕ (saflaútÕrma katsayÕsÕ ve protein da÷Õlma katsayÕsÕ) 124 90,5 90 200 89,5 150 89 100 88,5 Verim (%) Geri kazanÕm (%) 250 88 50 0 87,5 10 25 50 Geri KazanÕm (%) 154 214 151 Verim (%) 88 90 Sistem hacmi (ml) 90 87 ùekil 4.22 Büyük ölçekli PEG 3000- Na2SO4 sisteminde invertaz enziminin saflaútÕrma Spesifik aktivite (üst) (U/mg protein) sonuçlarÕ (geri kazanÕm ve verim) 400 300 200 100 0 Spesifik aktivite üst 10 25 50 308 377 324 Sistem hacmi (ml) ùekil 4.23 10, 25 ve 50 ml’lik sistemlerde saflaútÕrÕlan invertaz enziminin spesifik aktivite de÷erleri. 125 Son adÕmda enzimin bulundu÷u PEG fazÕndan PEG’i uzaklaútÕrmak ve enzimi deriútirmek için preparat 10 000 MW’lik membrandan ultrafiltre edilmiútir. Deriútirilen enzimin protein miktarÕ 0,291 mg/ml, spesifik aktivitesi 677 U/mg olarak hesaplanmÕútÕr. Ultrafiltrasyon sonrasÕnda elde edilen enzim preparatÕ homojenata kÕyasla 31 kat saflaútÕrÕlmÕútÕr. Enzimin saflÕ÷ÕnÕ kontrol etmek ve molekül kütlesini belirlemek için SDS-PAGE yapÕlmÕú enzim karakterize edilmiútir. 4.3 Domates Karakterizasyonu (Lycopersicon esculentum) ønvertazÕnÕn 4.3.1 ønvertaz aktivitesine pH etkisi Enzimlerin aktivitesini etkileyen en önemli faktörlerden birisi pH etkisidir. Bir enzimin pH optimumu, reaksiyon süresi, sÕcaklÕk, substrat yapÕsÕ ve konsantrasyonu, kullanÕlan tampon türü ve konsantrasyonu, ortamÕn iyonik úiddeti, enzimin saflÕ÷Õ gibi birçok deneysel parametreye ba÷ÕmlÕ bir de÷iúkendir. Biyokimyasal reaksiyonlar, in vivo koúullarda, sulu ortamda gerçekleúti÷inden pH enzimin yük durumunu dolayÕsÕyla aktivitesini çok etkiler. ønvertaz aktivitesine pH’Õn etkisi ve optimum pH bölüm 3.6.1.1’de açÕklandÕ÷Õ gibi belirlenerek ùekil 4.24’de verilmiútir. Bunun için inkübasyon tamponunun pH’sÕ 4,0–8,0 arasÕnda de÷iútirilerek enzimin aktivitesi standart koúullarda ölçülerek belirlenmiútir. ùekil 4.24’den görüldü÷ü gibi domates invertazÕnÕn optimum pH’sÕ 5,0 olarak bulunmuútur. Bitkisel kaynaklÕ asidik invertazlarÕn optimum pH de÷erleri genellikle 3,5–6,5 arasÕnda 126 de÷iúmektedir (bakÕnÕz Çizelge 1.5) (Belcarz et al., 2002; Liu et al., 2006; Rojo et al., 1998). 120 Ba Õl Aktivite (% ) 100 80 60 40 20 0 3,5 4 4,5 5 5,5 6 6,5 7 7,5 8 8,5 pH ùekil 4.24 ønvertaz aktivitesine pH’Õn etkisi (optimum pH) (Substrat: Sükroz, SÕcaklÕk: 37oC, Tamponlar: pH; 4,0–5,5; Asetat, 6,0–8,0 Fosfat) 4.3.2 ønvertaz aktivitesine sÕcaklÕ÷Õn etkisi Enzimlerin katalitik aktivitesi sÕcaklÕ÷a ba÷ÕmlÕdÕr. Ba÷Õl aktivitenin sÕcaklÕk ile de÷iúimini gösteren optimum e÷rilerinden enzimin optimum sÕcaklÕk de÷eri belirlenir. SÕcaklÕ÷Õn invertaz aktivitesine etkisi bölüm 3.6.1.2’de açÕklandÕ÷Õ gibi enzimin aktivitesinin farklÕ sÕcaklÕklarda standart koúullarda ölçülmesiyle belirlenmiú ve bu iliúki ùekil 4.25’de verilmiútir. 127 120 BaÕl Aktivite (% ) 100 80 60 40 20 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 o SÕcaklÕk ( C) ùekil 4.25 ønvertaz aktivitesine sÕcaklÕ÷Õn etkisi (optimum sÕcaklÕk) (Substrat: Sükroz; ønkübasyon süresi: 30 dakika) ùekil 4.25’den görüldü÷ü gibi enzim için optimum sÕcaklÕk de÷eri 50 C olarak bulunmuútur. Enzimler protein yapÕdaki büyük ve oldukça komplike moleküllerdir. Aktivitenin korunmasÕ için üç boyutlu yapÕsÕ korunmalÕdÕr. Aktiviteye etki eden önemli parametrelerden biri de sÕcaklÕktÕr. Reaksiyon hÕzÕ sÕcaklÕk arttÕkça artar. Fakat belirli sÕcaklÕktan sonra enzim proteinin denaturasyonundan dolayÕ aktivitede düúme olur. Enzimin maksimum aktivite gösterdi÷i sÕcaklÕk (optimum sÕcaklÕk) özellikle operasyonel bir parametre olmasÕ açÕsÕndan önemlidir. Genellikle bitkisel kaynaklÕ invertazlarÕn optimum sÕcaklÕ÷Õ kayna÷a ve inkübasyon süresine ba÷lÕ olarak 37-60oC arasÕnda de÷iúmektedir (De o Ginés et al., 2000; Fernández et al., 2004; Belcarz et al., 2002). 128 4.3.3 ønvertaz aktivitesine substrat konsantrasyonunun etkisi ønvertazlarÕn kinetik sabitleri genellikle kaynaklarÕna ve substratlarÕna ba÷lÕ olarak oldukça geniú bir aralÕkta de÷iúmektedir. Domates invertazÕnÕn Km de÷eri (substrat: sükroz) bitkisel kaynaklÕ birçok invertaz ile benzerlik göstermektedir. Literatür çalÕúmalarÕna bakÕldÕ÷Õnda enzimin substrata afinitesini yansÕtan Km de÷erinin ço÷u kez ya çok az de÷iúti÷i ya da hiç de÷iúmedi÷i görülmektedir. Domates invertazÕnÕn kinetik parametreleri do÷al substratlardan sükroz kullanÕlarak bölüm 3.6.1.3’de açÕklandÕ÷Õ gibi test edilerek belirlenmiútir (ùekil 4.26). Doygunluk substrat konsantrasyonunu ve Km ile Vmax de÷erlerini belirleyebilmek için 0,01–2 M sükroz konsantrasyon aralÕ÷Õ kullanÕlarak enzimlerin aktiviteleri standart koúullarda (37oC’de 30 dakika inkübasyon) ölçülmüútür. ùekil 4.26’dan görüldü÷ü gibi doygunluk substrat (sükroz) konsantrasyonu invertaz için 0,75 M olarak belirlenmiútir. Bu de÷erlerin üzerindeki konsantrasyonlarda aktivitede belirgin bir de÷iúiklik gözlenmemektedir. Sükroz ile ilgili LineweaverBurk diyagramÕ Sigma Plot programÕyla çizilerek ùekil 4.27’de verilmiútir. Sükrozun substrat oldu÷u koúullarda invertaz için çizilen Lineweaver-Burk diyagramÕndan (1/S’a karúÕ 1/V) Km ve Vmax de÷erleri sÕrasÕyla 48 mM ve 31 U olarak belirlenmiútir. 129 ùekil 4.26 Sükroz konsantrasyonunun invertaz aktivitesine etkisi (substrat [S]: Sükroz, sÕcaklÕk: 37oC, inkübasyon süresi: 30 dakika) (Michaelis Menten grafi÷i) ùekil 4.27 ønvertaz enziminin Lineweaver-Burk diyagramlarÕ (substrat [S]: Sükroz, sÕcaklÕk: 37oC, inkübasyon süresi: 30 dakika) 130 ønvertazlarÕn kinetik sabitleri genellikle kaynaklarÕna ve substratlarÕna ba÷lÕ olarak oldukça geniú bir aralÕkta de÷iúmektedir. Domates invertazÕnÕn Km de÷eri (Substrat: Sükroz) bitkisel kaynaklÕ birçok invertaz ile benzerlik göstermektedir. Literatür çalÕúmalarÕna bakÕldÕ÷Õnda enzimin sükroz afinitesini yansÕtan Km de÷erleri 0.05–227 mM arasÕnda farklÕlÕk gösterdi÷i görülmektedir (bakÕnÕz Çizelge 1.3) (Liebl et al., 1998; Huang et al., 2003; Weersaooriya and Yatawara, 2002). 4.3.4 ønkübasyon süresinin etkisi ønkübasyon süresinin invertaz aktivitesi üzerine etkisi Bölüm 3.6.1.4’ te açÕklandÕ÷Õ gibi 0, 10, 20, 30, 40, 50 ve 60 dakika boyunca 37oC’de inkübe edilerek standart koúullarda aktivitesinin ölçülmesiyle belirlenmiútir. ùekil 4.28’de inkübasyon süresinin enzim reaksiyonuna etkisi verilmiútir. ùekilden görüldü÷ü gibi invertaz enzimi için uygun reaksiyon süresi 30 dakika olarak belirlenmiútir. Glukoz Konsantrasyonu (mol/mg) 250 200 150 100 50 0 0 10 20 30 40 50 60 70 nkübasyon süresi (dakika) ùekil 4.28 ønkübasyon süresinin invertazÕn açÕ÷a çÕkardÕ÷Õ glukoz miktarÕ ile iliúkisi (substrat: Sükroz, sÕcaklÕk: 37oC) 131 4.3.5 Efektör konsantrasyonunun etkisi Bölüm 3.6.1.5’ te açÕklandÕ÷Õ gibi bazÕ metal iyonlarÕnÕn ve maddelerin farklÕ konsantrasyonlarÕnÕn enzim aktivitesi üzerine etkisi incelenmiútir. Çizelge 4.3’ de domatesten elde edilen enzim preparatÕ için metal konsantrasyonlarÕnÕn invertaz aktivitesine etkisi belirtilmiútir. Çizelge 4.3’den görüldü÷ü gibi domatesten elde edilen invertazÕn aktivitesi metal iyonlarÕnÕn etkisine karúÕ dirençlidir. MnSO4.H2O ve Mn+2 iyonlarÕ 1 mM konsantrasyonlarÕnda aktivatör etkisi göstermektedir. Cu+2 iyonu 2,5 mM konsantrasyonda invertaz aktivitesini yaklaúÕk % 48.6 oranÕnda inhibe etmektedir. BunlarÕn yanÕ sÕra 0,1, 1–2,5 mM konsantrasyonlardaki di÷er efektörlerin enzimi çok düúük oranda inhibe etti÷i belirlenmiútir. Çizelge 4.3 Çeúitli efektörlerin invertaz aktivitesine etkisi. Efektör 0,1 mM 1 mM 2,5 mM Kontrol 100,0 100,0 100,0 NaCl 98,1 97,8 97,5 KCl 101,3 96,2 96,1 MgCl2.6H2O 96,1 95,6 92,7 MgSO4.7H2O 97,4 95,7 90,4 BaCl2.2H2O 103,5 95,3 95,8 CaCl2 97,7 96,2 84,1 MnSO4.H2O 112,2 161,3 120,9 ZnSO4.7H2O 92,5 93,7 72,3 Na2CO3 90,6 89,8 82,7 CuSO4.5H2O 84,6 79,6 48,6 FeCl3.6H2O 99,4 93,2 97,6 MnCl2.4H2O 123,8 150,3 138,4 Türü/Konsantrasyonu 132 4.4 KararlÕlÕk Testleri Enzim preparatlarÕnÕn kararlÕlÕ÷Õ, belirli çalÕúma koúullarÕnda enzim aktivitesinin zamana ba÷ÕmlÕ olarak korunmasÕdÕr. Enzimlerin kararlÕlÕ÷Õ denince genellikle proteinin konformasyonel kararlÕlÕ÷Õndan söz edilir. Enzimin termal, pH ve depo kararlÕlÕklarÕ büyük ölçüde konformasyonel kararlÕlÕ÷Õ ile belirlenir ve denaturasyon sonucu da inaktivasyon gerçekleúir. Bir enzimin kararlÕlÕ÷Õ; sÕcaklÕk, pH, iyon úiddeti, tampon türü, substratÕn varlÕ÷Õ ve yoklu÷u, enzim konsantrasyonu, inkübasyon zamanÕ, aktivatör ya da inhibitörlerin varlÕ÷Õ ve yoklu÷una ba÷lÕ olarak de÷iúim gösteren önemli bir parametredir. Çünkü enzimler oldukça karmaúÕk yapÕlÕ proteinlerdir. Enzimin üç boyutlu yapÕsÕna etki edecek bir faktör, enzimin aktivitesini de etkiler (Telefoncu, 1997). Domatesten saflaútÕrÕlan invertazÕn kararlÕlÕklarÕ ile ilgili sonuçlar ilgili bölümlerde grafiklerle açÕklanmÕútÕr. 4.4.1 ønvertazÕn termal kararlÕlÕ÷Õ Enzimlerin kararlÕlÕ÷Õna etki eden parametrelerden en önemlisi sÕcaklÕktÕr. Genellikle enzimler düúük sÕcaklÕklarda daha kararlÕ olurken yüksek sÕcaklÕklarda hÕzla termal denaturasyon gerçekleúir. ønvertazÕn termal kararlÕlÕ÷Õ bölüm 3.6.2.1’de açÕklandÕ÷Õ gibi belirlenmiútir (ùekil 4.29). Bunun için enzim önce farklÕ sÕcaklÕklarda (4-70oC) inkübe edildikten sonra standart koúullarda aktiviteleri ölçülmüútür. 133 120 BaÕl Aktivite (%) 100 80 60 40 20 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 o SÕcaklÕk ( C) ùekil 4.29 ønvertazÕn termal kararlÕlÕ÷Õ (Substrat: Sükroz; SÕcaklÕk: 37oC; ønkübasyon süresi: 30 dakika) ùekil 4.29’dan görüldü÷ü gibi enzimin termal kararlÕlÕ÷ÕnÕn 4-50oC arasÕnda oldukça iyi oldu÷u, 50oC’de enzimin aktivitesinin % 54’sini korudu÷u belirlenmiútir. 50oC’nin üstündeki sÕcaklÕklarda, enzim aktivitesini hÕzlÕ bir úekilde kaybetmektedir. ønvertaz enzimi kayna÷a ba÷lÕ olarak çeúitli kararlÕlÕk dereceleri göstermektedir (bakÕnÕz Çizelge 1.4) (Weersaooriya and Yatawara, 2002; Warchol et al., 2002; Rahman et al., 2001). 4.4.2 ønvertazÕn pH kararlÕlÕ÷Õ Tüm enzimler birer protein olup, kararlÕlÕklarÕna etki eden her faktör proteinin sekonder, tersiyer ve/veya kuarter yapÕlarÕnÕ etkileyecektir. Ço÷u enzim aúÕrÕ asidik ya da bazik koúullarda tersinmez denaturasyona u÷rar. Bir enzimin pH kararlÕlÕ÷Õ birçok faktör (inkübasyon koúullarÕ, sÕcaklÕk, inkübasyon süresi, tampon türü ve 134 konsantrasyonu, substrat konsantrasyonu, iyonik úiddet gibi) ile modifiye edilebilir. ønvertazlarÕn pH kararlÕlÕ÷Õ bölüm 3.6.2.2’de açÕklandÕ÷Õ gibi belirlenmiútir (ùekil 4.30). Bunun için enzim farklÕ pH’lardaki tamponlarda 6 saat boyunca bekletilmiú ve ardÕndan ortamÕn pH’sÕ 5.0’ya ayarlanarak standart koúullar altÕnda aktiviteleri ölçülmüútür. ùekil 4.30’dan görüldü÷ü gibi invertaz, pH 4,0–6,5 arasÕnda oldukça kararlÕdÕr. pH 4,0–6,5 arasÕnda aktivitesini yaklaúÕk % 97,2 oranÕnda korumaktadÕr. ønvertazlarÕn ço÷u oldukça geniú bir pH aralÕ÷Õnda kararlÕdÕr (Belcarz et al., 2002; Gines et al., 2000; Rojo et al., 1998). 120 BaÕl Aktivite (%) 100 80 60 40 20 0 3,5 4 4,5 5 5,5 6 6,5 7 7,5 8 8,5 pH ùekil 4.30 ønvertazÕn pH kararlÕlÕ÷Õ (Substrat: Sükroz; SÕcaklÕk: 37oC; Tamponlar: pH 4,0–5,5; Asetat, pH 6,0–8,0; Fosfat; ønkübasyon süresi: 30 dakika) 135 4.4.3 ønvertazÕn depo kararlÕlÕ÷Õ Depo kararlÕlÕ÷Õ, özellikle enzimlerin uygulama alanÕ ile ilgili önemli bir faktördür. Enzimin saklanma koúullarÕna ba÷lÕ bir parametredir. ATPS sistemi ile saflaútÕrÕlan invertazÕn depo kararlÕlÕ÷Õ bölüm 3.6.2.3’ de belirtildi÷i gibi ölçülmüú ve sonuçlar ùekil 4.31’de verilmiútir. ùekilden görüldü÷ü gibi domates invertazÕnÕn depo kararlÕlÕ÷Õ oldukça iyi olup enzim 59 gün sonunda baúlangÕç aktivitesinin % 53’ünü korumaktadÕr. 120 BaÕl Aktivite (% ) 100 80 60 40 20 0 0 10 20 30 40 50 60 Depolama süresi (gün) ùekil 4.31 Domates invertazÕnÕn depo kararlÕlÕ÷Õ 70 136 4.5 Genel De÷erlendirme ønvertaz (EC 3.2.1.26) enzimi ile ilgili izolasyon, saflaútÕrma ve karakterizasyon çalÕúmalarÕ çok eski yÕllardan beri devam etmektedir. Bir çok farklÕ tür kaynaktan; bitkisel (Benkeblia et al., 2004; Fotopoulos, 2005; Weersaooriya and Yatawara, 2002; Hashizume et al., 2003; Abdou, 2004; Liu et al., 2006) ve mikrobiyal (Belcarz et al., 2002; AitAbdelkader et al., 2000; Ghosh et al., 2001; Warchol et al., 2002; Nguyen et al., 2005) bilinen genel izolasyon ve saflaútÕrma teknikleri kullanÕlarak izole edilip saflaútÕrÕlan enzimin, karakterizasyonu yapÕlarak uygulamaya sunulmuútur. Bölüm 1.1.6’da ayrÕntÕlÕ bir olarak açÕklandÕ÷Õ gibi enzim bir çok alanda uygulama olana÷Õ bulmuútur. ønvertaz, úeker endüstrisinde (SaldamlÕ, 2005), karbohidrat yapÕ çalÕúmalarÕ ile biyolojik fonksiyonlarÕnÕn belirlenmesinde (Frevert and Ballou, 1982; Gómez and Villalonga, 2000; Kern et al., 1992; Zeng and Biemann, 1999), immobilizasyon çalÕúmalarÕnda (Tomotani and Vitolo, 2006; Bayramo÷lu et al., 2002; Sanjay and Sugunan, 2004; Bagal and Karve, 2005; Gürsel et al., 2003), transglikozilasyon reaksiyonlarÕnda (Rubio et al., 2002; Nguyen et al., 2004; L’Hocine et al., 2000; Yanahira et al., 1998) ve hayvanlar ile insanlarda intestinal sistemde konstipasyon sorununun giderilmesini sa÷layan oligosakkaritlerin sentezi gibi enzimatik sentezlerde (Nguyen et al., 2005; Hidaka et al., 1987) önemli uygulama alanlarÕ bulmuú bir enzimdir. Her ne kadar oldukça yüksek saflÕkta ve hemen hemen tamamen homojen bir invertaz preparatÕnÕn hazÕrlanabildi÷i çok az sayÕda çalÕúma mevcut ise de, önemli olan daha sonraki çalÕúmalarda kullanÕlabilecek amaca uygun bir protein preparatÕnÕn hazÕrlanmasÕdÕr. ønvertazlar genellikle hücre içerisinde ve de di÷er çeúitli glikozidazlarla bir arada bulunurlar. Bu nedenle ço÷u kez bu aktiviteleri birbirinden ayÕrmak oldukça zor olmaktadÕr. E÷er hazÕrlanan 137 enzim preparatÕ di÷er glikozidazlarca kontamine edilmiyor ve geniú bir aglikon spesifikli÷ine sahip ise yukarÕda belirtilen bir çok kullanÕm alanÕ için uygun olacaktÕr. Rekombinant proteinlerin ve enzimlerin üretimi için makul fiyata yeterli saflaútÕrmayÕ gerçekleútiren teknolojilerin geliúmesine ihtiyaç duyulmaktadÕr. Bu sebeple bilim insanlarÕ daha ekonomik protein saflaútÕrma teknikleri geliútirmek için u÷raúmaktadÕrlar. Son elli yÕlda, araútÕrmacÕlar protein geri kazanÕmÕ ve saflaútÕrÕlmasÕ için sÕvÕ-sÕvÕ ekstraksiyon sistemlerine ilgi duymaktadÕrlar. Normalde sÕvÕ-sÕvÕ ekstraksiyonu organik çözgenlerin kullanÕmÕnÕ içermektedir. Ancak proteinler organik çözgenlerde çözünememekte ve denaturasyona u÷ramaktadÕrlar. SÕvÕ-sÕvÕ ikili faz sistemleri iki polimer veya polimer / tuz çözeltileri kullanÕlarak da oluúturulabilmektedir. Sulu ikili faz sistemleri (Aqueous Two Phase Systems: ATPS) biyolojik moleküllerin (örne÷in; protein, hücre, organel ve biyolojik membranlar) ekstraksiyonu ve saflaútÕrÕlmasÕnda kullanÕlan seçimli ve etkin bir metoddur. Sulu ikili faz sistemleri biyo-uyumlulu÷a sahiptir ve % 70–90 gibi oldukça yüksek su içeri÷inden dolayÕ biyomoleküller için toksik olmayan ÕlÕmlÕ bir çevre oluúturmaktadÕr. AyrÕca polimerlerin protein ve enzim aktivitesi ve yapÕsÕna stabilize edici etkileri vardÕr. Sulu ikili faz sistemleri bilinen ayÕrma ve saflaútÕrma tekniklerine (kromatografi, filtrasyon, santrifüjleme ve elektroforez) göre bazÕ avantajlarÕ vardÕr. Sulu ikili faz ayÕrma tekni÷i özellikle tek adÕmda saflaútÕrma için uygundur. Bir adÕmdan oluúan bir iúlemle istenilen proteinin deriútirilmesi ve saflaútÕrmasÕnÕ gerçekleútirebilmektedir. Sulu ikili faz sisteminin bir baúka üstünlü÷ü ise ölçek büyütmenin kolayca 138 mümkün olmasÕdÕr. Yöntemin di÷er avantajlarÕ ise; ara yüzey geriliminin düúük olmasÕ nedeniyle biyomoleküllerin degradasyonunu minimize etmesi, proses zamanÕ ve enerji tüketiminin düúük olmasÕ, yüksek rezolusyon ve verimlilikte ayÕrÕmÕn gerçekleútiriliebilmesi ve maliyetin düúük olmasÕ olarak sÕralanabilir (Yue et al., 2007; Negrete et al., 2007). Bu çalÕúmada, tomates invertazÕnÕn sulu ikili faz sistemi ile saflaútÕrÕlmasÕ amaçlanmÕútÕr. Enzim kayna÷Õ tarama çalÕúmasÕ sonucunda, domatesin di÷er enzim kaynaklarÕna göre dikkate de÷er oranda daha yüksek bir invertaz aktivitesine sahip olmasÕ ve di÷er pek çok kaynakta mevcut úeker oranÕnÕn domatese kÕyasla oldukça yüksek olmasÕ ve bu nedenle de özellikle aktivite tayin aúamalarÕnda giriúime sebep olmalarÕ nedeniyle sulu ikili faz sistemi ile invertaz enziminin saflaútÕrÕlmasÕnda domatesin daha uygun bir kaynak olaca÷Õna karar verilmiútir. AyrÕca domates, ülkemizde her mevsim kolaylÕkla temin edilebilen, ucuz ve bol bulunan bir kaynak olmasÕ, invertaz aktivitesinin bu kaynakta yüksek oranda bulunmasÕ ve güneú altÕnda yetiúen domatesteki enzimlerin termal kararlÕ÷ÕnÕn genellikle yüksek olmasÕndan dolayÕ da tercih edilmiútir. ønvertaz enzimi domatesten ekstrakte edilerek % 15 PEG–3000, % 12 Na2SO4 ve % 5 KCl (pH 4.5, 25oC) sulu ikili faz sistemi ile saflaútÕrÕlmÕú ve karakterize edilmiútir. Bu amaçla, enzim aktivitesine etki eden bazÕ parametrelerin (inkübasyon süresi, pH, sÕcaklÕk, substrat miktarÕ, efektör türü ve konsantrasyonu) etkisi incelenerek kararlÕlÕk testleri (termal, pH, depo) yapÕlmÕútÕr. Enzim aktivitesi dinitrosalisilik asit (DNS) metodu ile, protein tayini ise Bradford metodu ile gerçekleútirilmiútir. 139 % 15 PEG–3000, % 12 Na2SO4 ve % 5 KCl (pH 4.5, 25oC) kullanÕlarak hazÕrlanan sulu ikili-faz sisteminde invertaz enzimi PEG’ce zengin üst fazda toplanmÕútÕr. Enzimin molekül kütlesi SDS-PAGE ile yaklaúÕk 20 kDa olarak, optimum pH ve sÕcaklÕ÷Õ ise sÕrasÕyla 5,0 ve 50oC olarak belirlenmiútir. Enzimin Km ve Vmax de÷erleri sÕrasÕyla 48 mM ve 31 U olarak belirlenmiútir. Polimer-Tuz tabanlÕ ATPS ile saflaútÕrÕlan domates invertazÕ geniú bir pH ve sÕcaklÕk aralÕ÷Õnda oldukça kararlÕ bir enzim preparatÕdÕr. Geleneksel metodlara kÕyasla, invertazÕn saflaútÕrÕlmasÕnda kullanÕlan bu tek adÕmlÕ ekstraksiyon metodu basit, ekonomik ve etkili bir metod olup hazÕrlanan enzim preparatÕ sahip oldu÷u katalitik özellikleri bakÕmÕndan gÕda sanayinde kullanÕlabilecek uygun bir enzim preparatÕdÕr. 140 KAYNAKLAR DøZøNø Abdou, H.M., 2004, Purification and properties of invertase from Portulaca oleracea plant, Egypt Journal of Biotechnology, 16: 317330. Agrawell, K.M.L., Bahl, O.P., 1968, Glycosidases of Phaseolus vulgaris II: isolation and general properties, The Journal of Biological Chemistry, 243: 13-18. Ait-Abdelkader, N., De Caro, A., Guzzo, J., Michel, G.P.F., Baratti, J.C., 2000, The intracellular sucrase (SacA) of Zymomonas mobilis is not involved in sucrose assimilation, Biotechnology Letters, 22: 461-467. Alberto, F., Bingon, C., Sulzenbacher, G., Henrissat, B., Czjzek, M., 2004, The three-dimensional structure of invertase (ȕ-fructosidase) from Thermotoga maritima reveals a bimodular arrangement and an evolutionary relationship between retaining and inverting glycosidases, The Journal of Biological Chemistry, 279: 1890318910. Alberto, F., Jordi, E., Henrissat, B., Czjzek, M., 2006, Crystal structure of inactivated Thermotoga maritima invertase in complex with the trisaccharide substrate raffinose, The Biochemical Journal, 395: 457-462. Albertsson, P.A., 1985, Partitioning in Aqueous Two-Phase Systems, Academic press, New York, 1-8p. 141 KAYNAKLAR DøZøNø (devam) Ålbertsson, P.Å., 1986, Partition of cell particles and macromolecules, 3rd ed. Wiley, New York. Albertsson, P.A., Johansson, G., Tjerneld, F., 1990, Separation Process in Biotechology, Editor J.A. Asenjo, New York, 287p. Álvaro-Benito, M., De Abreu, M., Fernández-Arrojo, L., Plou, F.J., Jiménez-Barbero, J., Ballasteros, A., Polaina, J., FernándezLobato, M., 2007, Characterization of a ȕ-fructofuranosidase from Schwanniomyces occidentalis with transfructosylating activity yielding the prebiotic 6-kestose, Journal of Biotechnology, 132: 7581. Antov, M.G., Periþin, D.M., Dašiü, M.G., 2006, Aqueous two-phase partitioning of xylanase produced by solid-state cultivation of Polyporus squamosus, Process Biochemistry, 41: 232-235. Arruda, L.M.O., Vitolo, M., 1999, Characterization of invertase entrapped into calcium alginate beads, Applied Biochemistry and Biotechnology, 81: 23-33. Asthir, B., Singh, R., 1997, Purification and characterization of neutral invertase from chickpea nodules, Indian Journal of Biochemistry & Biophysics, 24: 529-534. Babu, B.R., Rastogi, N.K., Raghavarao, K.S.M.S., 2008, Liquid–liquid extraction of bromelain and polyphenol oxidase using aqueous twophase system, Chemical Engineering and Processing, 47: 83–89. 142 KAYNAKLAR DøZøNø (devam) Bagal, D., Karve, M.S., 2006, Entrapment of plant invertase within novel composite of agarose-guar gum biopolymer membrane, Analytica Chimica Acta, 555: 316-321. Bahar, T., Tuncel, A., 2004, Concanavalin A carrying reactive beads for yeast invertase purification, Reactive & Functional Polymers, 61: 203–210. Balasubramaniam, D., 2003, Lysozyme separation from tobacco extract by aqueous two-phase extraction, http://scholar.lib.vt.edu/theses/available/etd-02192003164258/unrestricted/final_thesis.pdf Bamberger, S., Seaman, G.V.F., Brown, J.A., Brooks D.E., 1984, The partition of sodium phosphate and sodium chloride in aqueous dextran poly(ethylene glycol) two-phase systems, Journal of Colloid and Interface Science, 99: 187-193. Bansal-Mutalik, R., Gaikar, V.G., 2005, Purification and recovery of enzymes from baker’s yeast by reverse micellar solutions, Process Biochemistry, 41 (1): 131-141. Baseer, A., Shall, S., 1971, Properties of the internal invertase of yeast, Saccharomyces cerevisiae, Biochimica et Biophysica Acta, 250: 192-202. 143 KAYNAKLAR DøZøNø (devam) Batta, S.K., Singh, J., Sharma, K.P., Singh, R., 1991, Kinetic properties and inhibition of soluble acid invertase from sugarcane juice, Plant Physiology and Biochemistry, 29: 415-419. Bayramo÷lu, G., Akgöl, S., Bulut, A., Denizli, A., ArÕca, M.Y., 2003, Covalent immobilisation of invertase onto a reactive film composed of 2-hydroxyethyl methacrylate and glycidyl methacrylate: properties and application in a continuous flow system, Biochemical Engineering Journal, 14 (2):117-126. Belcarz, A., Ginalska, G., Lobarzewski, J., Penel, C., 2002, The novel non-glycosylated invertase from Candida utilis (the properties and the conditions of production and purification), Biochimica et Biophysica Acta, 1594: 40-53. Benkeblia, N., Onodera, S., Yoshihira, T., Kosaka, S., Shiomi, N., 2004, Effect of temperature on soluble invertase activity and glucose, fructose and sucrose status of onion bulbs (Allium cepa) in store, International Journal of Food Sciences and Nutrition, 55 (4): 325-331. Berggren, K., Nilsson, A., Johansson, G., Bandmann, N., Nygren, P., Tjerneld, F., 2000, Partitioning of peptides and recombinant protein–peptide fusions in thermoseparating aqueous two-phase systems: effect of peptide primary structure, Journal of Chromatography B, 743: 295–306. 144 KAYNAKLAR DøZøNø (devam) Beúel, E., 2003, Use of Triton X-114 aqueous two phase system for recovery of mushroom (Agaricus bisporus) polyphenoloxidase, http://etd.lib.metu.edu.tr/upload/1262971/index.pdf Biazus, J.P.M., Santana, J.C.C., Souza, R.R., Jordão, E., Tambourgi E.B., 2007, Continuous extraction of Į- and ȕ-amylases from Zea mays malt in a PEG4000/CaCl2 ATPS, Journal of Chromatography B, 858: 227-233. Bim, M.A., Franco, T.T., 2000, Extraction in aqueous two-phase systems of alkaline xylanase produced by Bacillus pumilus and its application in kraft pulp bleaching, Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications, 743: 349-356. Boddy, L.M., Berges, T., Barreau, C., Vainstein, M.H., Dobson, M.J., Ballance, D.J., Peberdy, J.F., 1993, Purification and characterization of an Aspergillus niger invertase and its DNA sequence, Current Genetics, 24: 60-66. Bonomo, R.C.F., Minim, L.A., Coimbra, J.S.R., Fontan, R.C.I., Da Silva, L.H.M., Minim, V.P.R., 2006, Hydrophobic interaction adsorption of whey proteins: effect of temperature and salt concentration and thermodynamic analysis, Journal of Chromatography B, 844: 6-14. Bosch, S., Grof, C.P.L, Botha, F.C., 2004, Expression of neutral invertase in sugarcane, Plant Science, 166:1125–1133. 145 KAYNAKLAR DøZøNø (devam) Bradford, M.M., Analytical Biochemistry, 1976, 72, 248-254. Brenda, The Comprehensive fructofuranosidase, Enzyme Information System, ȕ- http://www.brenda-enzymes.org/php/result_flat.php4?ecno=3.2.1.26 Bugbee, W.M., 1984, Partial purification and properties of an invertase from Pseudomonas fluorescens, Canadian Journal of Microbiology, 30: 1326-1329. Carvalho, C.P., Coimbra, J.S.R., Costa, I.A.F., Minim, L.A., Silva, L.H.M., Maffia, M.C., 2007, Influence of the temperature and type of salt on the phase equilibrium of PEG1500/potassium phosphate and PEG1500/sodium citrate aqueous two-phase systems, Journal of Chemical & Engineering Data, 52: 351. Cascone, O., Andrews, B.A., Asenjo, J.A., 1991, Partitioning and purification of thaumatin in aqueous two-phase systems, Enzyme and Microbial Technology, 13: 629-635. Cavalcanti, M.T.H., Carneiro-da-Cunha, M.G., Brandi, I.V., Porto, T.S., Converti, A., Lima Filho, J.L., Porto, A.L.F., Pessoa A., 2007, Continuous extraction of Į-toxin from a fermented broth of Clostridium perfringens Type A in perforated rotating disc contactor using aqueous two-phase PEG–phosphate system, Chemical Engineering and Processing: Process Intensification, In Press. 146 KAYNAKLAR DøZøNø (devam) Cazy, Carbohydrate-Active Enzymes, Glycoside Hydrolase. http://www.cazy.org/fam/acc_GH.html Chávez, F.P., Rodriguez, L., Díaz, J., Delgado, J.M., Cremata, J.A., 1997, Purification and characterization of an invertase from Candida utilis: comparison with natural and recombinant yeast invertases, Journal of Biotechnology, 53: 67-74. Chen, J.Q., Black, C.C., 1992, Biochemical and immunological properties of alkaline invertase isolated from sprouting soybean hypocotyls, Archives of Biochemistry and Biophysics, 295: 61-69. Chen, J., Saxton, J., Hemming, F.W., Peberdy, J. F., 1996, Purification and partial characterization of the high and low molecular weight form (S- and F-form) of invertase secreted by Aspergillus nidulans, Biochimica et Biophysica Acta (BBA) Protein Structure and Molecular Enzymology, 1296 (2): 207-218. Da Silva, C.A.S., Coimbra, J.S.R., Rojas, E.E.G., Minim, L.A., Da Silva, L.H.M., 2007, Partitioning of caseinomacropeptide in aqueous two-phase systems, Journal of Chromatography B, 858: 205–210. De Aguiar Oliveira, I.M., Park, Y.K., 1995, Screening of betafructofuranosidase producing microorganisms for production of fructooligosaccharides and studies of some enzyme properties, Revista de Microbiologia, 26: 125-129. 147 KAYNAKLAR DøZøNø (devam) De Ginés, S.C., Maldonado, M.C., De Valdez, G.F., 2000, Purification and Characterization of invertase from Lactobacillus reuteri CRL 1100, Current Microbiology, 40: 181-184. De la Vega, M.G., Cejudo, F.J., Paneque, A., 1991, Purification and properties of an extracellular invertase from Azotobacter chroococcum, Enzyme and Microbial Technology, 13: 267-271. De Rezende, S.T., Felix, C.R., 1999, Production and characterization of raffinose-hydrolysing and invertase activities of Aspergillus fumigatus, Folia Microbiologica, 44: 191-195. Den Hollander, J.L., Wong, Y.W., Luyben, K.Ch.A.M., Van der Wielen, L.A.M., 1999, Non-separating effects in a centrifugal partition chromatographic reactor for the enzymatic production of L-amino acids, Chemical Engineering Science, 54: 3207-3215. Dreier, L.P., Hunter, J.J., Ruffner, H.P., 1998, Invertase activity, grape berrry development and cell compartmentation, Plant Physiology and Biochemistry, 36: 865-872. Duan, K.J., Sheu, D.C., Chen, J.S., 1993, Purification and characterization of beta-fructofuranosidase from Aspergillus japonicus TIT-KJ1, Bioscience, Biotechnology and Biochemistry, 57: 1811-1815. 148 KAYNAKLAR DøZøNø (devam) Eiteman, M.A., Gainer, J.L., 1991, Partition of isomeric dipeptides in poly(ethylene glycol)/magnesium sulfate aqueous two-phase systems, Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects, 1073: 451-455. Engel, S., Barak, Z., Chipman, D.M., Merchuk, J. C., 2000, Purification of acetohydroxy acid synthase by separation in an aqueous two-phase system, Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications, 743: 281-286. Ettalibi, M., Baratti, J.C., 1987, Purification, properties and comparison of invertase, exoinulinase and endoinulinase of Aspergillus ficuum, Applied Microbiology and Biotechnology, 26: 13-20. Faye, L., Berjonneau, C., Rollin, P., 1981, Studies on beta-fructosidase from radish seedlings: purification and partial characterization, Plant Science Letters, 22: 77-87. Falco, A.L.P., Durrant, L.R., Franco, T.T., 2000, Purification of Įgalactosidase from seeds of Sesbania marginata, Brazilian Journal of Chemistry, 17: 4-7. Fernández, R.C., Maresma, B.G., Juárez, A., Martínez, J., 2004, Production of fructooligosaccharides by ȕ-fructofuranosidase from Aspergillus sp 27H, Journal of Chemical Technology and Biotechnology, 79: 268-272. 149 KAYNAKLAR DøZøNø (devam) Ferreira, M.S.S., de Andrade, A.V.M., Kennedy, J.F., 1991, Properties of a thermostable nonspecific fructofuranosidase produced by Cladosporium cladosporioides cells for hydrolysis of Jerusalem artichoke extract, Biotechnology, 31: 1-9. Applied Biochemistry and Fotopoulos, V., 2005, Plant invertases: structure, function and regulation of a diverse enzyme family, Journal of Biological Research, 4: 127-137. Franco, T.T., Andrews B.A., Asenjo, A.J., 1996, Use of chemically modified proteins to study the effect of a single protein property on partitioning in aqueous two-phase systems: effect of surface hydrophobicity, Biotechnology and Bioengineering, 19: 300-308. Frevert, J., Ballou, C.E., 1982, Yeast invertase polymorphism is correlated with variable states of oligosaccharide chain phosphorylation, Proc. Nad. Acad. Sci., 79: 6147-6150. Fu, R.-H., Wang, Y.-L., Sung, H.-Y., 2003, Cloning, characterization and functional expression of a new beta-D-fructofuranosidase (Osbetafruct2) cDNA from Oryza sativa, Biotechnology Letters, 25: 455-459. Gascon, S., Neumann, N.P., Lampen, J.O., 1968, Comparative study of the properties of the purified internal and external invertases from yeast, Journal of Biological Chemistry, 243: 1573-1577. 150 KAYNAKLAR DøZøNø (devam) Ghosh, K., Dhar, A., Samanta, T.B., 2001, Purification and characterization of an invertase produced by Aspergillus ochraceus TS, Indian Journal of Biochemistry & Biophysics, 38: 180-185. Goetz, M., Roitsch, T., 1999, The different pH optima and substrate specificities of extracellular and vacuolar invertases from plants are determined by a single amino acid substitution, The Plant Journal, 20 (6): 707-711. Gomes, G.A., Azevedo, A.M., Aires-Barros, M.R., Prazeres, D.M.F., 2008, Purification of plasmid DNA with aqueous two phase systems of PEG 600 and sodium citrate/ammonium sulfate, Separation and Purification Technology, In Press. Gómez, L., Villalonga, R., 2000, Functional stabilization of invertase by covalent modification with pectin, Biotechnology Letters, 22: 1191–1195. Goupil, P., Croisille, Y., Croisille, F., Ledoigt, G., 1988, Jerusalem artichoke invertases -immunocharacterization of a soluble form and its putative precursor, Plant Science, 54: 45-54. Guimarães L.H.S., Terenzi H.F., Polizeli M.L.T., Jorge J.A., 2007, Production and characterization of a thermostable extracellular ȕD-fructofuranosidase produced by Aspergillus ochraceus with agroindustrial residues as carbon sources, Enzyme and Microbial Technology, 42: 52-57. 151 KAYNAKLAR DøZøNø (devam) Gürsel, A., Alkan, S., Toppare, L., Ya÷cÕ, Y., 2003, Immobilization of invertase and glucose oxidase in conducting H-type polysiloxane/polypyrrole block copolymers, Reactive & Functional Polymers, 57: 57-65. Han, J.H., Lee, C.-H., 1997, Effects of salts and poly(ethylene glycol)palmitate on the partitioning of proteins and Bacillus subtilis neutral protease in aqueous two-phase systems, Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 9(1-2): 109-116. Hashizume, H., Tanase, K., Shiratake, K., Mori, H., Yamaki, S., 2003, Purification and characterization of two soluble acid invertase isozymes from Japanes pear fruit, Phytochemistry, 63: 129-129. Hatti-Kaul, R., 2000, Aqueous Two-Phase Systems, Methods and Protocols, Humana Press Inc., New Jersey, Editor: R., Hatti-Kaul, 440p. He, G.-Q., Zhang, X.-Y., Tang, X.-J., Chen Q.-H., Ruan, H., 2005, Partitioning and purification of extracellular ȕ-1,3-1,4-glucanase in aqueous two-phase systems, Journal of Zhejiang University Science, 6B(8): 825-831. Hidaka, H., Eida, T., Adachi, T., Sito, Y., 1987, Industrial production of fructooligosaccharides and its application for human and animals, Nippon Nogeikagaku Kaishi, 61: 915-923. 152 KAYNAKLAR DøZøNø (devam) Hsiao, C.-C., Fu, R.-H., Sung, H.-Y., 2002, A novel bound form of plant invertase in rice suspension cells, Bot. Bull. Acad. Sin, 43: 115-122. Huang, W.C., Wang, A.Y., Wang, L.T., Sung, H.Y., 2003, Expression and characterization of sweet potato invertase in Pichia pastoris, Journal of Agriculture and Food Chemistry, 51: 1494-1499. Isabel D.V.M., Otero, C., 2003, Biphasic aqueous media containing polyethylene glycol for the enzymatic synthesis of oligosaccharides from lactose, Enzyme and Microbial Technology, 33: 118–126. Ishikawa, N., Nakagawa, H., Ogura, N., 1989, Isoforms of invertase in grape berries, Agricultural Biology and Chemistry, 53: 837-838. Ishimoto, M., Nakamura, A., 1997, Purification and properties of betafructofuranosidase from Clostridium perfringens, Bioscience, Biotechnology and Biochemistry, 61: 599-603. Isla, M.I., Vattuone, M.A., Gutierrez, M.I., Sampietro, A.R., 1988, Acid invertase from Tropaeolum leaves, Phytochemistry, 27: 19931998. Isla, M.I., Vattuone, M.A., Ordóñez, R.M., Sampietro, A.R., 1999, Invertase activity associated with the walls of Solanum tuberosum tubers, Phytochemistry, 50: 525-534. 153 KAYNAKLAR DøZøNø (devam) Jacob, G.S., Scudder, P., 1994, Glycosidases in structural analysis, Methods in Enzymology, Academis Pres, New York, 230: 280p. Janer, C., Rohr, L. M., Peláez, C., Laloi, M., Cleusix, V., Requena, T., Meile, L., 2004, Hydrolysis of oligofructoses by the recombinant ȕ-fructofuranosidase from Bifidobacterium lactis, Systematic and Applied Microbiology, 27: 279-285. Johansson, G., 1985, Aqueous two-phase systems in protein purification, Journal of Biotechnology, 3: 11–18. Kepka, C., Collet, E., Persson, J., Ståhl, Å., Lagerstedt, T., Tjerneld, F., Veide, A., 2003, Pilot-scale extraction of an intracellular recombinant cutinase from E. coli cell homogenate using a thermoseparating aqueous two-phase system, Journal of Biotechnology, 103: 165-181. Kern, G., Schulke, N., Schmid, F.X., Jaenicke, R., 1992, Stability, quaternary structure, and folding of internal, external and coreglycosylated invertase from yeast, Protein Science, 120-131. Klomklao, S., Benjakul, S.,Visessanguan, W., Simpson, B.K., Kishimura, H., 2005, Partitioning and recovery of proteinase from tuna spleen by aqueous two-phase systems, Process Biochemistry, 40(9): 3061-3067. 154 KAYNAKLAR DøZøNø (devam) Krishnan, H.B., Blanchette, J.T., Okita, T.W., 1985, Wheat invertases: characterization of cell wall-bound and soluble forms, Plant Physiology, 787: 241-245. Laemmli, U.K., 1970, Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4, Nature, 227: 680-685. Lammens, W., Le Roy, K., Van Laere, A., Rabijns, A., Van den Ende, W., 2008, Crystal structure of Arabidopsis thaliana cell-wall invertase mutants in complex with sucrose, Journal of Molecular Biology, 377: 378-385. Leal, D.P., Isla, M.I., Vattuone, M.A., Sampietro A.R., 1999, A hysteretic invertase from Equisetum giganteum L, Phytochemistry, 52: 1009-1016. Lee, H.S., Sturm, A., 1996, Purification and characterization of neutral and alkaline invertase from carrot, Plant Physiology, 112: 1513- 1522. Legler, G., Korth, A., Berger, A., Ekhart, C., Gradnig, G., Stutz, A.E., 1993, ,5-Dideoxy-2,5-imino-D-mannitol and -D-glucitol: two-step bio-organic syntheses from 5-azido-5-deoxy-Dglucofuranose and -L-idofuranose; evaluation as glucosidase inhibitors and application in affinity purification and characterisation of invertase from yeast, Carbohydrate Research, 250: 67-77. 155 KAYNAKLAR DøZøNø (devam) Leigh, R.A., Rees, T., Fuller, W.A., Banfield, J., 1979, The location of acid invertase activity and sucrose in the vacuoles of storage roots of beetroot (Beta vulgaris), Journal of Biochemistry, 178: 539-547. L’Hocine, L., Wang, Z., Jiang, B., Xu, S., 2000, Purification and partial characterization of fructosyltransferase and invertase from Aspergillus niger AS0023, Journal of Biotechnology, 81: 73-84. Liebl, W., Brem, D., Gotschlich, A., 1998, Analysis of the gene for ȕfructosidase (invertase, inulinase) of the hyperthermophilic bacterium Thermotoga maritima, and characterisation of the enzyme expressed in Escherichia coli, Applied Microbiology and Biotechnology, 50: 55-64. Lingle, S.E., Dunlap, J.R., 1987, Sucrose metabolism in netted muskmelon fruit during development, Plant Physiology, 84: 386389. Liu, C.-C., Huang, L.-C., Chang, C.-T., Sung, H.-Y., 2006, Purification and characterization of soluble invertases from suspension-cultured bamboo (Bambusa edulis) cells, Food Chemistry, 96: 621-631. Lopez, M.E., Vattuone, M.A., Sampietro, A.R., 1988, Partial purification and properties of invertase from Carica papaya fruits, Phytochemistry, 27: 3077-3081. 156 KAYNAKLAR DøZøNø (devam) Marcos, J.C., Fonseca, L.P., Ramalho, M.T., Cabral, J.M.S., 1999, Partial purification of penicilin acylase from Escherichia coli in poly(ethylene glycol)-sodium citrate aqueous two-phase systems, Journal of Chromatography B, 734: 15-22. Masayoshi, M., Teruo, N., 1995, Enzymatic synthesis of novel fructosyl and oligofructosyl trehaloses by Aspergillus sydowi ȕfructofuranosidase, Bioscience, Biotechnology and Biochemistry, 59: 208-212. Masuda, H., Sugawara, S., 1980, Purification and some properties of cell wall-bound invertases from sugar beet seedlings and aged slices of mature roots, Plant Physiology, 66: 93-96. McCarter, J.D., Withers, S.G., 1994, Mechanisms of enzymatic glycoside hydrolysis, Current Opinion in Structural Biology, 4: 885-892. Meachum, Z.D., Colvin, H.R., Braymer, H.D., 1971, Chemical and physical studies of Neurospora crassa invertase: molecular weight, amino acid and carbohydrate composition, and quaternary structure, Biochemistry, 10: 326-332. Michaelis, L., Menten, M.L., 1913, Die kinetik der invertin-wirkung, Biochemische Zeitschrift, 49: 333–396. 157 KAYNAKLAR DøZøNø (devam) Miller, W.B., Ranwala, A.P., 1994, Characterization and localization of three soluble invertase forms from Lilium longiflorum flower buds, Physiologia Plantarum, 92 (2): 247-253. Minuth, T., Thömmes, J., Kula, M.-R., 1995, Extraction of cholesterol oxidase from Nocardia rhodochrous using a nonionic surfactant- based aqueous two-phase Journal of Biotechnology, 38: 151-164. system, Mohamadi, H.S., Omidinia, E., Dinarvand, R., 2007, Evaluation of recombinant phenylalanine dehydrogenase behavior in aqueous two-phase partitioning, Process Biochemistry, 42: 1296-1301. Morell, M., Copeland, L., 1984, Enzymes of sucrose breakdown in soybean nodules, Plant Physiology, 74: 1030-1034. Moreno, S., Sanchez, Y., Rodriguez, L., 1990, Purification and characterization of the invertase from Schizosaccharomyces pombe, Biochemical Journal, 267: 697-702. Moriguchi, T., Sanada, T., Yamaki, S., 1991, Properties of acid invertase purified from peach fruits, Phytochemistry, 30: 95-97. Nadkarni, M.A., Pandey, V.N., Pradhan, D.S., 1993, An invertase with unusual properties secreted by sucrose-grown cells of Corynebacterium murisepticum, Indian Journal of Biochemistry & Biophysics, 30: 156-159. 158 KAYNAKLAR DøZøNø (devam) Nakagawa, H., Kawasaki, Y., Ogura, N., Takehana, H., 1971, Purification and some properties of two types of betafructofuranosidase from tomato fruit, Agricultural Biology and Chemistry, 36: 18-26. Nakamura, M., Hagimori, M., Matsumoto, T., 1988, Purification and characterization of acid invertase from cultured tobacco cells, Agricultural and Biological Chemistry, 52 (12): 3157-3158. Negrete, A., Ling,T. C., Lyddiatt, A., 2007, Aqueous two-phase recovery of bio-nanoparticles: a miniaturization study for the recovery of bacteriophage T4, Journal of Chromatography B., 854: 13-19. Neumann, N.P., Lampen, J.O., 1967, Purification and properties of yeast invertase, Biochemistry, 6: 468-475. Nguyen, Q.D., Rezessy-Szabó, J.M., Bhat, M.K., Hoschke, Á., 2005, Purification and some properties of ȕ-fructofuranosidase from Aspergillus niger IMI303386, Process Biochemistry, 40: 24612466. Nishizawa, M., Maruyama, Y., Nakamura, M., 1980, Purification and characterization of invertase isoenzymes from Fusarium oxysporum, Agricultural Biology and Chemistry, 44: 489-498. 159 KAYNAKLAR DøZøNø (devam) Obenland, D.M., Simmen, U., Boller, T., Wiemken, A., 1993, Purification and characterization of three soluble invertases from barley (Hordeum vulgare L.) leaves, Plant Physiology, 101: 1331- 1339. Önal, S., Telefoncu, A., 1998, Some properties of Į-galactosidase extracted from tomato and pineapple, Journal of Faculty of Science Ege University, 121 (1): 113-124. Pan, Q., Zou, K., Peng, C., Wang, X., Zhang, D., 2005, Purification, biochemical and immunological characterization of acid invertases from apple fruit, Journal of Integrative Plant Biology Formerly Acta Botanica Sinica, 47: 50-59. Prado, F.E., Vattuone, M.A., Fleischmacher, O.L., Sampietro, A.R., 1985, Purification and characterization of Ricinus communis invertase, Journal of Biological Chemistry, 260: 4952-4957. Pressey, R., Avants, J.K., 1980, Invertases in oat seedlings, Plant Physiology, 65: 135-140. Quiroga, E.N., Vattuone, M.A., Sampietro, A.R., 1995, Purification and characterization of the invertase from Pycnoporus sanguineus, Biochimica et Biophysica Acta, 1251: 75-80. 160 KAYNAKLAR DøZøNø (devam) Rahman, M.H., Akand, A.S.M.A.H., Yaesmin, T., Udin, M.S., Rahman, M., 2001, Purification and properties of invertase from mango fruit, Pakistan Journal of Biological Sciences, 4 (10): 12711274. Reddy, V.A., Maley, F., 1990, Identification of an active-site residue in yeast invertase by affinity labeling and site-directed mutagenesis, The Journal of Biological Chemistry, 265: 10817-10820. Reddy, A., Maley, F., 1996, Studies on identifying the catalytic role of Glu-204 in the active site of yeast invertase, The Journal of Biological Chemistry, 271: 13953-13958. Rojo, H.P., Quiroga, E.N., Vattuone, M.A., Sampietro, A.R., 1998, Nicotiana glauca invertase: characterization and effects of endogenous alkaloids, Phytochemistry, 49: 965-969. Roobol-Bóza, M., Dolby, V., Doverskog, M., Barrefelt, Å., Lindqvist, F., Oppermann, U.C., Alstine, K.K.V., Tjerneld, F., 2004, Membrane protein isolation by in situ solubilization, partitioning and affinity adsorption in aqueous two-phase systems: purification of the human type 1 11ȕ-hydroxysteroid dehydrogenase, Journal of Chromatography A, 1043: 217-223. Rodriguez, M., Gomez, A., Gonzalez, F., Barzana, E., LopezMunguia, A., 1996, Selectivity of methyl-fructoside synthesis with ȕ-fructofuranosidase, Applied biochemistry and biotechnology, 59: 167-176. 161 KAYNAKLAR DøZøNø (devam) Roitsch, T., González, M.-C., 2004, Function and regulation of plant invertases: sweet sensations, Trends in Plant Science, 9 (12): 606613. Rojo, H.P., Quiroga, E.N., Vattuone, M.A., Sampietro, A.R., 1998, Nicotiana glauca invertase: characterization and effects of endogenous alkaloids, Phytochemistry, 49 (4): 965-969. Rosa, P.A.J., Azevedo, A.M., Aires-Barros, M.R., 2007, Application of central composite design to the optimisation of aqueous two-phase extraction of human antibodies, Journal of Chromatography A, 1141: 50-60. Rubio, M.C., Maldonado, M.C., 1995, Purification and characterization of invertase from Aspergillus niger, Current Microbiology, 31: 80- 83. Rubio, M.C., Runco, R., Navarro, A.R., 2002, Invertase from a strain of Rhodotorula glutinis, Phytochemistry, 61: 605–609. Salabat, A., Abnosi, M.H., Bahar, A.R., 2007, Amino acids partitioning in aqueous two-phase system of polypropylene glycol and magnesium sulfate, Journal of Chromatography B, 858: 234-238. SaldamlÕ, ø., 2005, GÕda KimyasÕ. 162 KAYNAKLAR DøZøNø (devam) Sanjay, G., Sugunan, S., 2006, Enhanced pH and thermal stabilities of invertase immobilizied on montmorillonite K-10, Food Chemistry, 94: 573-579. Sato, M., Kaji, A., 1976, An acid- and heat-stable betafructofuranosidase from Corticium rolfsii, Agricultural Biology and Chemistry, 40 : 2107-2108. Schaffer, A.A., 1986, Invertases in young and mature leaves of Citrus sinensis, Phytochemistry, 25: 2275-2277. Singh, M.B., Knox, R.B., 1984, Invertases of Lilium polen, Plant Physiology, 74: 510-515. Sinnot, M.L., 1990, Catalytic mechanisms of enzymic glycosyl transfer, Chemical Review, 90: 1171-1202. Snyder, S.M., Cole, K.D., Szaig, D.C., 1992, Phase compositions, viscosities and densities for aqueous two phase systems composed of polyethylene glycol and various salts at 25° C, Journal of Chemical & Engineering Data, 37: 268–274. Srinivas, N.D., Rashmi, K.R., Raghavarao, K.S.M.S., 1999, Extraction and purification of a plant peroxidase by aqueous two-phase extraction coupled with gel filtration, Process Biochemistry, 35: 43-48. 163 KAYNAKLAR DøZøNø (devam) Sturm, A., 1999, Invertases. Primary structures, functions and roles in plant development and sucrose partitioning, Plant Physiology, 121: 1–7. Su, C.-K., Chiang B.H., 2006, Partitioning and purification of lysozyme from chicken egg white using aqueous two-phase system, Process Biochemistry, 41(2): 257-263. Sutherland, I.A., Audo, G., Bourton, E., Couillard, F., Fisher, D., Garrard, I., Hewitson, P., Intes, O., 2008, Rapid linear scale-up of a protein separation by centrifugal partition chromatography, Journal of Chromatography A, 1190: 57-62. Tanaka, N., Ohuchi, N., Mukai, Y., Osaka, Y., Ohtani, Y., Tabuchi, M., Bhuiyan, M.S.A., Fukui, H., Harashima, S., Takegawa, K., 1998, Isolation and characterizatio of an invertase and its repressor genes from Schizosaccharomycess pombe, Biochemical and Biophysical Research Communications, 245: 246-253. Tang, X., Ruffner, H.P., Scholes, J.D., Rolfe, S.A., 1996, Purification and characterisation of soluble invertases from leaves of Arabidopsis thaliana, Planta, 198: 17-23. Telefoncu, A., 1986, Enzimolojinin prensibleri, Temel ve UygulamalÕ Enzimoloji (Yaz Okulu). Editör: A. Telefoncu, 18s. 164 KAYNAKLAR DøZøNø (devam) Telefoncu, A., 1996, Protein saflaútÕrma stratejisi ve amacÕ, Protein SaflaútÕrÕlmasÕ ve Karakterizasyonu (Yaz Okulu), Editör A. Telefoncu, 18s. Tomotani, E.J., Vitolo, M., 2006, Catalytic performance of invertase immobilized by adsorption on anionic Exchange resin, Process Biochemistry, 41 (6): 1325-1331. Trindade, I.P., Diogo, M.M., Prazeres, D.M.F., Marcos, J.C., 2005, Purification of plasmid DNA vectors by aqueous two-phase extraction and hydrophobic interaction chromatography, Journal of Chromatography A, 1082 (2): 176-184. Uslan, A.A., 1997, Enzimlerin etki mekanizmalarÕ ve aktif merkez tayini, Enzimoloji (Yaz Okulu), Editör: A. Telefoncu, 30s. Vaidya, B.K., Suthar, H.K., Kasture, S., Nene, S., 2006, Purification of potato polyphenol oxidase (PPO) by partitioning in aqueous twophase system, Biochemical Engineering Journal, 28(2): 161-16. Vailaya, A., Horváth, C., 1996, Retention Thermodynamics in Hydrophobic Interaction Chromatography, Industrial & Engineering Chemistry Research, 35: 2964-2981. Vorster, D.J., Botha, F.C., 1998, Partial purification and characterisation of sugarcane neutral invertase, Phytochemistry, 49: 651-655. 165 KAYNAKLAR DøZøNø (devam) Salabat, A., 2006, Prediction of liquid-liquid phase diagrams of aqueous salt + PEG systems using a thermodynamic model, Computer Coupling of Phase Diagrams and Thermochemistry, 30: 296-300. Schmidt, A.S., Ventom, A.M., Asenjo, J.A., 1994, Partitioning and purification of Į-amylase in aqueous two-phase systems, Enzyme and Microbial Technology, 16: 131-142. Su, C.-K., Chiang, B.H., 2006, Partitioning and purification of lysozyme from chicken egg white using aqueous two-phase system, Process Biochemistry, 41: 257-263. Simon G. Walker, Andrew Lyddiatt, 1998, Aqueous two-phase systems as an alternative process route for the fractionation of small inclusion bodies, Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications, 711: 185–194. Wang, L.T., Wang, A.Y., Hsieh, C.W., Chen, C.Y., Sung, H.Y., 2005, Vacuolar invertases in sweet potato: molecular cloning, characterization and analysis of gene expression, Journal of Agriculture and Food Chemistry, 53: 3672-3678. Warchol, M., Perin, S., Gril, J.-P., Schneider, F., 2002, Characterization of a purified ȕ-fructofuranosidase from Bifidobacterium infantis ATCC 15697, Letters in Applied Microbiology, 35: 462-467. 166 KAYNAKLAR DøZøNø (devam) Weersaooriya, M.K.B., Yatawara, H.P., 2002, Purification and properties of invertase from the flowers of Woodfordia fruticosa, Indian Journal of Biochemistry & Biophysics, 39: 347-350. Weil, M., Rausch, T., 1990, Cell wall invertase in tobacco crown gall cells: enzyme properties and regulation by auxin, Plant Physiology, 94: 1575-1581. West, C., Wade, M., McMillan III, C., Albersheim, P., 1980, Purification and properties of invertases extractable from Phytophthora megasperma var. sojae mycelia, Archives of Biochemistry and Biophysics, 201: 25–35. Win, T.T., Isono, N., Kusnadi, Y., Watanabe, K., Obae, K., Ito, H., Matsui, H., 2004, Enzymatic synthesis of two novel non reducing oligosaccharides using transfructosylation activity with ȕfructofuranosidase from Arthrobacter globiformis, Biotechnology Letters, 26: 499-503. Workman, W.E., Day, D.F., 1983, Purification and properties of the beta-fructofuranosidase from Kluyveromyces fragilis, FEBS Letters, 160: 16-20. Xu, Y., He, G.-Q., Li, J.-J., 2005, Effective extraction of elastase from Bacillus sp. Fermentation broth using aqueous two-phase system, Journal of Zhejiang University Science, 11: 1087–1094. 167 KAYNAKLAR DøZøNø (devam) Yanahira, S., Yabe, Y., Nakakoshi, M., Miura, S., Matsubara, N., Ishikawa, H., 1998, Structures of Novel Acidic Galactooligosaccharides Synthesized by Bacillus circulans ȕGalactosidase, Bioscience Biotechnology and Biochemistry, 62 (9): 1791. Yamada, K., Kojima, T., Bantog, N., Shimoda, T., Mori, H., Shiratake, K., Yamaki S., 2007, Cloning of two isoforms of soluble acid invertase of Japanese pear and their expression during fruit development, Journal of Plant Phtsiology, 164 (6): 746-755. Yue, H., Yuan, Q., Wang, W., 2007, Purification of phenylalanine ammonia-lyase in PEG1000/Na2SO4 aqueous two-phase system by a two-step extraction, Biochemical Engineering Journal, 37: 231237. Yun, H.S., Yoon, I.S., Kang, B.G., 2002, Rapid repression of vacuolar invertase in mungbean hypocotyl segments and regulation by sucrose, auxin and light, Plant Growth Regulation, 38: 181-189. Zaslavsky, B.Y., Miheeva L.M., Aleschko, P.Y., Mahmudov, A.U., Bagirov, T.O., Garaev, E.S., 1988, Distribution of inorganic salts between the coexisting phases of aqueous polymer two-phase systems: interrelationship between the ionic and polymer compousition of the phases, Journal of Chromatography, 439: 267- 281. 168 KAYNAKLAR DøZøNø (devam) Zeng, C., Biemann, K., 1999, Determination of N-linked glycosylation of yeast external invertase by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-night mass spectrometry, Journal of Mass Spectrometry, 34: 311-329. Zhai, S.L., Luo, G.S., Liu, J.G., 2001, Selective recovery of amino acids by aqueous two-phase electrophoresis, Chemical Engineering Journal, 83: 55-59. Zhang, H., Chi, Z., 2004, Inositol and phosphatidylinositol-mediated invertase secretion in Schizosaccharomyces pombe, Enzyme and Microbial Technology, 34: 213–218. Zihnio÷lu, F., 1996, Elektroforetik yöntemler, Protein SaflaútÕrÕlmasÕ ve Karakterizasyonu (Yaz Okulu), Editör A. Telefoncu, 150s. 169 ÖZGEÇMøù x AdÕ, SoyadÕ : ølke YÜCEKAN Do÷um Tarihi : 26.04.1984 Do÷um Yeri : K.ÇøFTLøK/LEFKOùA Medeni Hali : Bekar Uyru÷u : K.K.T.C. Ev Adresi : No:9 ÇakÕl Sokak SerdarlÕ / Gazima÷osa, KKTC E-mail : ilke_7@yahoo.com YabancÕ Dili : øngilizce Eitim Durumu : ølkö÷retim e÷itimini ùehit Tuncer ølkokulunda, orta e÷itimini ùehit Hüseyin Ruso Ortaokulunda ve lise e÷itimini ise Türk Maarif Kolejinde tamamladÕ. 2005 yÕlÕnda Ege Üniversitesi Fen Fakültesi Biyokimya Bölümünden Biyokimyager olarak mezun oldu. 2005 yÕlÕndan bu yana Ege Üniversitesi Biyokimya Bölümünde Yüksek Lisans e÷itimi almaktadÕr.