Klinik Tanıda Yeni Nesil Sıralama
Transkript
Klinik Tanıda Yeni Nesil Sıralama
Klinik Tanıda Yeni Nesil Sıralama: Erken Uygulamaya Koyanların Deneyimleri Moderatörler: Elaine Lyon1,2* ve Franklin R. Cockerill lll3,4,5 Uzmanlar: Sherri J. Bale6, Carol Beadling7, Lynn Bry8, Jill Hagenkord9, Shashikant Kulkarni10, Richard Press11 ve Glenn E. Palomaki12 1 Patoloji Doçenti, Utah Üniversitesi Tıp Fakültesi, Salt Lake City, UT; 2Tıbbi Direktör, Moleküler Genetik, ARUP Laboratuvarları, Salt Lake City, UT; 3Profesör ve Başkan, Tıbbi Laboratuvar ve Patoloji Bölümü ve 4Başkan ve CEO, Mayo Tıbbi Laboratuvarları, Mayo Kliniği, Rochester, MN; 5Mevcut bağlılığı, Quest Diagnostics (01/10/2014); 6İdari Direktör, GeneDx, Gaithersburg, MD; 7Direktör Yardımcısı, Patoloji Geçişi Araştırma Laboratuvarı, Knight Tanısal Laboratuvarları, Oregon Sağlık ve Bilim Üniversitesi, Portland, OR; 8Yönetici, Klinik ve Geçiş Metagenomik Merkezi, Brigham ve Kadın Hastanesi ve Patoloji Doçenti, Harvard Tıp Fakültesi, Boston, MA; 9Tıbbi Sorumlu, 23andMe, Inc. ve 10 Doçent, Patoloji ve İmmünoloji, Pediyatri ve Genetik, Sitogenomik ve Moleküler Patoloji Yöneticisi, Washington Üniversitesi Tıp Fakültesi, St. Louis, MO; 11Patoloji Bölümü ve Knight Kanser Enstitüsü, Oregon Sağlık ve Bilim Üniversitesi, Portland, OR; 12Patoloji ve Tıbbi Laboratuvar Bölümü, Kadın ve Bebek Hastanesi, Brown Üniversitesi Alpert Tıp Fakültesi, Providence, RI. * Bu yazarın iletişim bilgileri: ARUP Laboratories, 500 Chipeta Way, Salt Lake City, UT 84108. Faks 801584-5207; e-posta lyone@aruplab.com Standart dışı kısaltmalar: NGS, yeni nesil sıralama; MPS, yoğun paralel sıralama; NHGRI, Ulusal İnsan Genomu Araştırma Enstitüsü; NIBSC, Ulusal Biyolojik Standartlar ve Kontrol Enstitüsü; FFPE, formalinle sabitlenmiş, parafine yatırılmış; WES, tam ekzom sıralaması; CNV, kopya sayısı değişkeni; CAP, Amerikan Patologlar Birliği; SNV, tek nükleotid değişkeni; HMP, İnsan Mikrobiyom projesi; LIS, laboratuvar bilgi sistemi; ACMG, Amerikan Tıbbi Genetik ve Genomik Birliği; GUS, önemi bilinmeyen gen; VUS, önemi bilinmeyen değişken; IF, tesadüfi bulgu; HGMD, İnsan Gen Mutasyonu Veri Tabanı; ccf, dolaşımda hücre yok; NIPD, girişimsel olmayan doğum öncesi tanı; NIPT, NIP testi; NIPS, NIP tarama. Yoğun paralel sıralama (MPS) olarak ta adlandırılan yeni nesil sıralama (NGS), hızla klinik laboratuvar testleri ile bütünleştirilmektedir. Mevcut uygulama alanları arasında kalıtsak hastalıklardaki germ sırası değişkenlikleri, kanserlerdeki somatik değişkenler, dolaşımdaki hücresiz DNA alt popülasyonları ve enfeksiyonlar veya normal ya da farklılaşmış insan florasındaki tek viral ya da metamikrobiyal genomlar sayılabilir. Her uygulama özgündür ve kendine özgü avantaj ve dezavantajlara sahiptir. NGS süreçlerinin karmaşıklığı (numunelerin hazırlanması, test edilmesi ve çok fazla miktarda verinin incelenmesi) geçerliliğin doğrulanması, kalite kontrol ve verilerin yorumlanması ile ilgili laboratuvarların karşı karşıya kaldığı pek çok sorun oluşturmaktadır. Bu soru-cevap bölümünde farklı alanlardan (kalıtsal hastalıklar, kanser, enfeksiyöz hastalıklar ve gebelik tetkikleri) uzmanlar bu teknolojileri klinik kullanıma alma deneyimleri ile ilgili yanıtlar vermektedir. Yanıtları kişisel görüşlerini ve kendi uzmanlık alanlarına özgü deneyimlerini yansıtmaktadır. Uzmanlar ve ilgi alanları şu şekildedir: Sherri Bale ve Jill Hagenkord (kalıtsal hastalıklar); Richard Press, Carol Beadling ve Shashikant Kulkarni (onkoloji); Lynn Bry (enfeksiyöz hastalıklar); ve Glenn Palomaki (anne plazmasından girişimsel olmayan şekilde doğum öncesi genetik inceleme). Paylaştıkları deneyimler ve düşünceler karşılaşılan sorunların çeşitliliğini göstermekte ve nasıl çözüldüklerine dair örneekler sunmaktadır. Geçerlilik: Analitik geçerlilik klinik bir testin doğruluk ve tekrarlanabilirliğini, yani duyarlılık düzeyini ölçer. Genomik sıralama açısından duyarlılık, eğer varsa, genetik varyantları saptama yeteneğini, özgünlük ise “normal” (vahşi tip) sıralamayı doğru olarak belirleme derecesini ifade eder. 1: MPS kullanılan bir testin geçerliliğini belirlemenin en zor yönü hangisidir? Laboratuvarlar bu gereksinimleri nasıl karşılamıştır? Sherri Bale: MPS kullanılan bir testin geçerliliğini belirlerken karşılaşılan en önemli sorun üç bileşenin (sıralama platformu, genlerin özgün test/paneli ve biyoinformatik boru hattı) aynı anda optimizasyonunu gerektiren ve kendini tekrarlayan bir süreç olmasıdır. Sistemin herhangi bir parçası farklılaştırıldığında (örneğin, hedef zenginleştirme aşamasında başlangıçtaki DNA miktarını değiştirmek, yüzlerce bileşenden oluşan bir havuza tek bir öncül eklemek/değiştirmek veya informatik boru hattındaki bir parametreyi ayarlamak) bütün tetkikin geçerliliğinin baştan belirlenmesi gerekir. Bu testlerin tamamlanması günler, hatta haftalar sürdüğünden ve hatırı sayılır maliyetler söz konusu olduğundan bir NextGen panelinin geçerliliğinin araştırılması çok zaman alan, pahalı bir süreçtir. Jill Hagenkord: Geçerlilik araştırmasının en zor taraflarından biri değişkenlerin duyarlık ve özgünlüğünü saptamak için yeteri kadar geniş (10-100 bp) indeller içeren örnekler bulmaktır. Ben Coriell Enstitüsü’nde saklanan Ulusal İnsan Genomu Araştırma Enstitüsü (NHGRI) İnsan Genetik Araştırmaları için Numune Deposu İnsan Varyasyonları Alt Grubu kaynaklı, özellikleri iyi bilinen genomlardan elde edilen DNA örneklerini (Katalog ID NA19240, NA12878) kullanıyorum. Bu genomlar genomun kodlayan ve kodlamayan bölgelerinde yer alan binlerce yayınlanmış varyantı içerir. Mendel yasalarına göre hesaplama yapmaya olanak sağlayan akrabaların genomları da bulunmaktadır. Aynı zamanda Ulusal Biyolojik Standartlar ve Kontrol Enstitüsü’nden (NIBSC) numuneler de kullanıyorum. Bu genomlardaki geçerliliği saptanmış varyantlar NGS ile en kolay saptananlardır. Böylece geçerlilik araştırmasını bilinen genetik bozuklukların bulunduğu örneklerde yürütüyoruz. Richard Press ve Carol Beadling: Kanserle ilişkili mutasyonların NGS çalışmaları ile sınırlı olan bizim laboratuvarımızda geçerlilik araştırmalarında karşılaştığımız en büyük zorluk gerçeğin, yani bilinen geniş bir aralıktaki sıralama değişkenliklerini içeren veri ve/veya numune grubunun altın standardının ne olduğunu bulmaktır. Başarılı analizlerin ileriye doğru tekrarlanması sonucu belirlenen doğru sıralamanın optimizasyonu için parametre ayarlamaları yapılır, ancak hangi tekrarın optimum duyarlık ve özgünlüğü sağladığının belirlenmesi için hedef sıralamadaki her bir temelin bilinmesi gereklidir. Sonuçta laboratuvar topluluğu gerçeği farklı laboratuvarlarda ve farklı yöntemlerle elde edilen sonuçların bir fikir birliği şeklinde ifade etmektedir. Örneğin, NGS için sıralama numunenin türü (formalinle sabitlenmiş, parafine yatırılmışa [FFPE] karşılık doğal), istenen hedef (her tümör türü için farklıdır), saklamaya yönelik hazırlık yöntemi (PCR temelliye karşılık hibrid yakalama) ve sıralama platformuna bağlı olarak değişebilir. Dolayısıyla “gerçek” tanımı üzerinde bir fikir birliği sağlamak ciddi derecede zordur. Arşivimizde bilinen mutasyonları bulunan çok sayıda kanserli numune yer aldığından, farklı tümör türlerinde sık görülen varyantların (ve yalnızca bu varyantların) NGS temelli saptanması sürecinin duyarlılığını ve tekrarlanabilirliğini belirleme imkanına sahibiz. Ayrıca, başka bir platformda (Sanger sıralaması) NGS ile belirlenen yeni varyantların özgünlüğünü de değerlendirebiliyoruz. Ancak daha önce incelenen mutasyonların sayısı sınırlı olduğundan, başka pozisyonlardaki yalancı negatif bulguları ekarte etmek için kullanışlı bir yöntem yoktur. Benzer şekilde, panellerimizi daha fazla sayıda gen içerecek şekilde genişlettiğimizde teorik olarak daha önce hedeflenmeyen pozisyonlarda yalancı negatif bulgularla karşılaşma olasılığımız vardır. İdeal olmasa da bir diğer çözüm önerisi birbirinden kesin sınırlarla ayrılan mutasyon sınıflarının duyarlık, özgünlük ve tekrarlanabilirliğinin saptanması olabilir. Biz de bu sınıfların her birindeki tüm mutasyonları saptamada sıralama kimyası ve analiz hattının eşit derecede etkili olacağı varsayımıyla tüm tek nükleotid değişiklikleri, tüm eklenmeler ve tüm silinmeler için geçerlilik verilerini bir araya getirdik. Shashikant Kulkarni: MPS ile derin sıralama düşük düzeydeki (<%5 alel sıklığı) varyantları belirleyebilir. Sanger sıralaması gibi altın standart dikey yöntemlerle bu tür düşük seviyedeki varyantlar belirlenemez. Geçerlilik için pozitif kontrol numunelerinin bulunmaması en önemli sorunu oluşturmaktadır. Numune değişimi için pek çok laboratuvarla iletişim kurduk ve farklı genler için pozitif kontroller bulmakta çok güçlük çektik. Laboratuvarımızda 2011 yılında MPS hizmeti sunmaya başladığımızda altın standart verilerden oluşan referanslar henüz Referans Materyali Programı) ve NIST geçerlilik incelemelerinde kullanılabilecek referans genom verileri oluşturdu. Yakın geçmişte de farklı numune yapılarında (FFPE bloklar, hücre süspansiyonları) hücre dizilerinden hazırlanan ve niteliği iyi bilinen ticari ürünler piyasaya verilmeye başlamıştır. Saptama sınırlarının geçerliliğini belirlemek için bu ürünler farklı karışımlar halinde bulunmaktadır. Lynn Bry: Viral genotipleme tetkiklerinin dışındaki patojen genom sıralaması ya da metagenomik çalışmalarında Gıda ve İlaç Dairesi (FDA) onaylı platformlar, kitler ye da cihazlar kullanılmamaktadır. Ayrıca CLIA düzeyindeki tetkikleri destekleyecek içeriğe ya da referans genomlara sahip değiliz. Kalite parametreleri/mükemmellik testleri: Klinik laboratuvarlar gerçekleştirdikleri tetkiklerin performans özelliklerini izlerler. Genomik sıralama tetkiklerinde kalite güvencesi için farklı ya da ek parametreler gerekebilir. 2: Laboratuvarınızda her hasta ve her tetkik için hangi kalite parametrelerini kullanıyorsunuz? Mükemmellik ya da diğer değerlendirmeler için gereksinimleri nasıl karşılıyorsunuz? Sherri Bale: Biz NextGen panellerimizde sıralama kalitesi, kapsam derinliği ve Sanger doldurması için gerekli amplikon sayısını izliyoruz. Tam ekzom sıralama (WES) testlerinde kapsam derinliği (ortalama kapsam ile beraber 1X ve 10X düzeyindeki ekzom yüzdesi) heterozigot/homozigot oranları ve kopya sayısı varyant (CNV) saptamasını takip ediyoruz. Panellerin mükemmellik testleri (veya alternatif tetkikler) QA (kalite güvence)/QC bölümlerince geçmişte yapılan testlerden çok sayıda gen ve varyantları seçmek ve bunların mükemmellik incelemesi yapılmak üzere gönderildiğini bilmeyen laboratuvarlara göndermek suretiyle yürütülmektedir. WES için Amerikan Patoloji Birliği (CAP) aracılığı ile rastgele olarak seçilen beş WES laboratuvarından yararlanıyoruz ve tek nükleotid varyasyonu (SNV) saptanmasının uyumluluğunu değerlendiriyoruz. Jill Hagenkord: Hasta kalite parametreleri açısından DNA parmak izleri, cinsiyet kontrolü, beklenen genom davranışı (heterozigot/homozigot oranı ya da geçiş/dönüşüm oranı gibi), kontaminasyon ve GC yönlendirmesini kullanıyoruz. Varyant kalite skorları açısından ise alelik okuma yüzdeleri ve kapsamını kullanıyoruz. Yürütme parametreleri için ise yakalama ve sıralama ölçümlerinden yararlanıyoruz. DNA parmak izleri ve cinsiyet kontrolü numunenin işlem sırasında değiştirilmediğini doğrulayabilir. Toplam kontaminasyon oranı tüm homozigot varyant çağrılarının yerleşimlerindeki referans okumaların değerlendirilmesi ile hesaplanır. Referans alellerde rastgele hatadan beklenen düzeyin altında bir aşırılık uyumsuz çağrılara yol açan ikinci bir genomun varlığını gösterir. Bu yöntemle küçük miktarlardaki (<%5) kontaminasyon oranları doğru olarak tahmin edilebilir, ancak aynı durum büyük miktarlardaki kontaminasyonlar için geçerli değildir. Heterozigot/homozigot oranının artması da kontaminasyon düzeyinin yüksek olduğunu gösterir. İnsan genomu etnik farklılıklara göre değişiklik gösterebilen beklenen düzeyde varyantlar içerir. Afrika kökenlilerdeki varyant çeşitliliği beyazlardan fazladır. SNV/indel sayıları, heterozigot/homozigot oranları ve yenileşme hızları farklıdır. Çağrı doğruluğunu ölçmek için kullanılabilecek sabit ve özgün bir değer insan genomlarında yalnızca küçük bir aralıkta oynama gösteren geçiş SNV/dönüşün SNV oranıdır. Bu oranda hatırı sayılır bir sapma olması sistemik bir çağrı taraflılığını gösterir. SNP sayısının çok düşük olması duyarlılığın yetersiz olduğu anlamına gelir. GC taraflılığının izlenmesi numune hazırlanmasının kalitesi ve kapsamın doğruluğu hakkında bilgi sağlayabilir. Kapsam iki doğrultuda ölçülebilir: genişlik, yani bir genomun hangi sıklıkta çağrıldığı ve derinlik, yani her yerleşimde kaç tane örtüşen okumanın çağrıyı oluşturduğu. Genişlik ölçümünde seçilmiş üslerin yüzdesi kullanılabilir. Derinlik ölçümünde ise okuma derinliğinin >20 olduğu hedeflenmiş bölgeler yüzdesi ve haritalanmış üslerin toplam sayısından yaralanılabilir. Richard Press ve Carol Beadling: Önceleri FFPE ya da taze DNA örnekleri florometre ile ölçülürdü. A260/280 spektrofotometrik ölçümlerde DNA konsantrasyonları 10 kat ya da daha fazla yüksek bulunabilir. Biz sıralamadan önceki geçici formları ölçmek için PCR temelli teknikler kullanıyoruz. Sıralama sonrası amplikon başına ortalama sıralama okuma derinliği, hedef okuma yüzdesi, ortalama okuma uzunluğu ve her numune için okuma kalitesini izliyoruz. İstatistiksel hesaplara göre %5 düzeyinde bir alel varyantını saptamak için 450 AQ20 okuması yeterlidir. Amplikon başına yaklaşık 1500 okuma (taze lösemi numunelerinde daha da fazla) yapılır ki bu amplikonların %95’inden fazlasında >500 okuma yapıldığı anlamına gelir. Amplikon kitaplıklarında tipik olarak %95’ten fazla hedef okuma söz konusudur. Ek olarak her numunenin sıralı amplikon boyut dağılımı aşırılıklar açısından manüel olarak incelenir. Ayrıca mükemmellik değerlendirmesi için numune değişimi yapılır. Aynı ya da başka platformlarda Coriell Hap-Map gibi referans numuneler körlemesine olarak test edilir. Shashikant Kulkarni: Her hastaya kalite ölçütleri uygulanır ve referans aralıklarla (toplam okuma, genomun haritalanma yüzdesi, hedef okuma haritalanma yüzdesi, toplam hedef okuma sayısı, eşsiz olan hedef okuma yüzdesi, ortalama haritalama kalitesi, 50X, 400X ve 100X kapsama derinliklerinde eşsiz olan pozisyonların yüzdesi ve ortalama eşsiz kapsam) karşılaştırılır. Lynn Bry: Enfeksiyon ajanları açısından sıralama kalitesi ve kapsam için Phred skorları gibi standart parametrelere bakıyoruz ve teknik ya da biyoinformatik süreçlerin performansını değerlendirmek üzere bilinen kontrolleri ekliyoruz. Aynı zamanda analizlerde kullanılan oluşturulmuş içeriği de değerlendiriyoruz. Mikrobiyal idantifikasyonun bir parçası olarak referans sekansları kullanarak filogenetik bir ağaç oluşturuyor ve bilinmeyen organizmadan gelen sekansları yerleştiriyoruz. Böylece potansiyel direnç genlerini ve bilinen direnç genlerinin farklılaştırıcılarını saptıyoruz. HIV ve HCV (hepatit C virüsü) gibi referans içerik 10 yıldan uzun süredir klinik kullanımda olmakla birlikte başka virüsler, bakteriler ve ökaryot patojenler için içeriğin derinliği ve niteliği çok değişken olabilir. Sanger esaslı viral genotipleme dışında ABD’de enfeksiyöz hastalıklarda NGS uygulaması için mükemmellik test programları bulunmamaktadır. Çoğu olguda genom sıralaması bilinen referans organizmalar alınır veya 16S rRNA gen filotiplemesi ya da metagenomik analizler için tanımlanmış topluluklar oluşturulur. İnsan Mikrobiyom Projesi (HMP) bazı test materyalleri geliştirmiştir ve NIST iyi oluşturulmuş bakteri zincirlerinde iyi iş görmektedir. İnformatik: İnformatik oluşturulan verilerden iyi yararlanmak için gereklidir ve laboratuvarlar ya da dışarıdan yazılım şirketleri tarafından informatik iletim hatları geliştirlmiştir. 3: İnformatik iletim hatları için nelerin gereklilik oluşturduğunu düşünüyorsunuz ve bu konudaki yaklaşımınız nedir? Bu iletim hatlarının kalitesini nasıl değerlendiriyorsunuz? Sherri Bale: Biz bu iletim hatlarını çoğunlukla kendi bünyemizde oluşturuyoruz, ancak açık kaynaklar ya da lisanslı yazılımlardan da yararlanıyoruz. İletim hatlarımızı mükemmellik testi örnekleri kullanarak analiz ediyoruz ve yeni yazılımların β versiyonları çıktıkça verilerimizi denetliyoruz. Tamamen geçerli olduğunu göstermeden (ilk soruya bakınız) hiçbir iletim hattımızı güncellemiyor ya da yeni bir yazılım geliştirmiyoruz. Richard Press ve Carol Beadling: İnformatik bilgi hatlarının kalitesini değerlendirirken bir taraftan bilinen varyantların saptanması için duyarlık/özgünlüğü karşılaştırırken, bir taraftan da bu hattın hızına ve mevcut laboratuvar akışına uyarlanma kolaylığına bakıyoruz. Herhangi bir tetkik yönteminin yeni bir sürümü söz konusu olduğunda klinik uygulamaya girmeden önce geçerliliği (a) sekansın oluşturduğu veri bilgileri arşivinin yeniden incelenmesi ve (b) genotipleri bilinen numunelerin sıralamasının tekrar yapılması yoluyla denetlenir. Bu geçerlilik çalışmalarında karşılaşılan önemli bir sorun yeni varyantların yeni iletim hatları tarafından ortaya çıkarılıp çıkarılmadığının, önceki yöntemlerle belirlenip belirlenemediğinin ve gerçek pozitif sonuç olup olmadığının bilinememesidir. Yeni varyant varsayımları laboratuvarda yapılabiliyorsa Sanger sıralaması gibi yöntemlerle doğrulanabilir. Özellikle silinme-eklenme varyantları söz konusu olduğunda, yeni versiyonlarla genellikle eskilere göre daha uzun bir mutasyon listesi saptanmaktadır. Shashikant Kulkarni: MPS sıralamayı referans genomla karşılaştırıp varyantların saptayan karmaşık bir bilgisayar sürecidir. Yer değiştirmelerin, küçük ya da büyük eklenme ve silinmelerin ve kopya sayısı değişkenlerinin (CNV) saptanması için farklı yazılımlardan yararlanılır. Dahası, bu yazılımlar bir varyantın somatik mi, yoksa germ sırası ile mi ilgili olduğunu ayırt edecek şekilde optimize edilir. Bu analiz sürecinde herhangi bir aşamadaki herhangi bir değişiklik geçerliliğin yeniden belirlenmesini zorunlu kılar. Tabii ki bu zorunluluk değişikliğin boyutu ile bağlantılıdır; yeni bir varyantı belirleyecek değişikliğin geçerliliğinin baştan başlanarak belirlenmesi gerekirken, küçük bir yazılım değişikliği için yalnızca doğrulama yeterlidir. Geçerlilik uygun şekilde belirlendikten sonra iletim hattının sürümü yenilenir ve rutin üretime geçilir. Lynn Bry: İnformatik pek çok anlam taşıyabilir – enfeksiyon ajanları için klinik genomik testi kapsamında “Patoloji İnformatiği” genomik testinin mevcut laboratuvar tetkikleri ile ne şekilde bütünleştirildiği ile bağlantılıdır. Laboratuvar bilgi sistemi (LIS) bu karmaşık moleküler testlerin nerede analizlere dahil edileceği, bildirilebilir bir sonuca ulaşacağı, moleküler ya da genomik bulguların diğer fenotipik bilgilerle bütünleştirileceği ve faturalandırma ile ilgili bilgilere sahip olmalıdır. Bu bilgilerin bir bölümü LIS içerisinde yer alabilirse de, hiçbir tedarikçi tüm biyoinformatik, donanım, yazılım ve veri deposunu erişime açmaz. Biyoinformatik iletim hatlarının kalitesinin değerlendirilmesi klinik veya araştırma amacıyla kullanılması ile ilişkilidir. Tüm yöntem ve algoritmaların zayıf ve kuvvetli tarafları tam olarak anlaşılmalıdır. CAP NGS kontrol listesinin biyoinformatik bölümleri enfeksiyon hastalıkları için testler de dahil olmak üzere iletim hatları geliştirilmesi ve yönetimi için iyi bir başlangıç noktası oluşturur. Bu listelerde iletim hattı belgelenmesi, geçerliliğin değerlendirilmesi, kalite kontrol programı geliştirilmesi gibi genel gereksinimler ve her bir numune/olgu ile yapılan tüm incelemelerin izlenebilirliği gibi bilgiler yer alır. Farklı numune türleri ile ilgili sorunlar: 4: Tümör dokusu (biyopsi şekli, korumaya alınmış ya da taze, vs.) veya enfeksiyöz hastalıklar gibi farklı numune türleri için karşılaşılan başlıca sorunlar nelerdir? Richard Press ve Carol Beadling: FFPE kanser dokuları için başlıca sorun DNA parçalanmasına bağlı kalitenin değişkenlik göstermesi, kemik iliği numuneleri için ise deaminasyondur. Biz yetersizlik sınırı olarak hedef çevresinde en az 100 okuma olmasını kabul ediyoruz. Ayrıca deaminasyon lehine veri bulunan (C>A/G>A varyantları) numuneleri yetersiz olarak işaretliyoruz. Shashikant Kulkarni: FFPE bloğundan tümör dokusunu tam olarak işaretleyerek çevre dokudan diseksiyonunu sağlamak için kılavuz bir slayttan yararlanılabilir. Böylece tümör DNA içeriği zenginleştirilerek heterojeniteden kaynaklanan sorunların üstesinden gelinebilir. Lynn Bry: Enfeksiyon hastalıkları için test numuneleri saf bir mikrobiyal izolattan elde edilen bir nükleik asitten, konakçı hücrelere göre mikrop yükü düşük olan sıvı ve dokulara ya da dışkı gibi ortamda bulunan bakterilerin patojenlerden kat kat fazla olduğu steril olmayan numunelere kadar geniş bir aralıkta değişir. Ayrıca yöntem seçiminde GC içerik yüzdesi aralığı, genom uzunluğu, hareketli genetik elemanlar ve tekrarlana bölgeler de göz önüne alınmalıdır. Özellikle FFPE materyali söz konusu olduğunda malzemenin testten önce doğru şekilde saklanması da önemlidir. Numune alındığı andan itibaren çevresel kontaminasyon riski yüksektir. Geniş metagenomik yaklaşımlarda, hatta 16s rRNA gibi korunmuş hedeflerin amplifikasyonunda çevresel faktörlerin bulaşma olasılığı hesaba katılmalıdır. Varyant/gen öneminin yorumlanması ve bildirilmesi: Klinik laboratuvarlar tipik olarak varyantları sınıflamak için beş kademeli (patojen, olasılıkla patojen, bilinmeyen, olasılıkla benign, benign) bir sistem kullanırlar. Ancak bu sistem yalnızca hastalıklarla ilgili olduğu bilinen genler için geçerlidir. İncelenen pek çok somatik varyantın hastalığın ilerlemesi ya da tedavi yanıtı için önemli olduğu gösterilmiş olmakla birlikte genomik sıralama uygulamaları yeni varyantları ortaya çıkaracaktır. 5: Patojen bir varyant bulunduğunda hastalık fenotipi ile ilişkisi olup olmadığını nasıl anlıyorsunuz? Laboratuvarınız somatik varyantlara yol açan mutasyonları saptıyor olsaydı daha önce tanımlanmamış somatik varyantları nasıl yorumlardınız? Sherri Bale: Kalıtsal hastalıklarda önemli olduğu bilinen genlerin patojenitesini değerlendirirken Amerikan Tıbbi Genetik ve Genomik Birliği’nin (ACMG) kılavuzlarından yararlanıyoruz. Hastalık gelişimi ile Mendel kanunları düzeyinde olmayan ilişkisi bulunduğu bilinen genler için bu kılavuzları biraz modifiye etmiş bulunuyoruz ve bu durumdaki varyantları riskli aleller olarak bildiriyoruz. Jill Hagenkord: Beş kademeli sistem varyant sınıflandırması ile paralellik gösterir: hastalığa neden olan, hastalığa neden olması olası olan, önemi bilinmeyen (GUS), olasılıkla hastalığa neden olmayan. Varyant sınıflandırması gibi gen sınıflandırmasında da bir parça maharet gerekir. GUS kapsamında patojen veya olası patojen bir varyant bulunamaz, ancak önemi bilinmeyen bir varyant (VUS) bulunabilir. Pazardan tersine yönde bir talep olsa da gen panellerini belirlerken önemi bilinmeyen genleri içermemesine dikkat ediyoruz. Ancak panel talebinde bulunan hekimlerin hastalarına belirsizlik açıklaması yaparken pek zorlanmadığını da gözlüyoruz. Krichard Press ve Carol Beadling: Somatik mutasyon testleri yapıyoruz ve varyantları yorumlarken genel veri tabanları (COSMIC, My Cancer Genome, Leiden Open Variation Database, dbSNP, 1000 genomes), yayınlanmış literatür (PubMed) ve mutasyon sıralamalarının öngörücülerinden (SIFT, PolyPhen2) yararlanıyoruz. Aynı zamanda kendi varyant ve tümör arşivimize de başvuruyoruz. NGS ile saptanan bir varyanta ait alel sıklığı morfoloji ya da akım sitometrisi ile saptanan tümör yüküne göre çok daha fazla bilgi vermektedir. Örneğin, alel yükü %50 olan yeni bir varyant saptadığımızda eğer morfolojik tümör yükü yalnızca %20 ise bu varyantı bir germ dizisi olarak adlandırma eğiliminde oluruz ve olasılıkla tümörle ilişkili olmadığı sonucuna varırız. Ek olarak lösemi olgularında seri NGS çalışmaları ile tedavi öncesi ve sonrası varyant alel sıklıklarını karşılaştırarak patojenite hakkında bir ipucu elde ederiz. Daha önce bilinmeyen şeklinde sınıflandırılmış bir varyantın alel sıklığının %50 düzeyinde kalmaya devam ettiği bir tedavi sonrası lösemi olgusunu özellikle diğer yöntemlerle lösemi yükünün azaldığı gösterilmişse tümör ile bağlantılı olmayan bir germ dizisi olarak sınıflandırmak daha doğrudur. Yorumlamaya yardımcı olan kaynaklara rağmen, hala sıklıkla daha önceden tanımlanmamış varyantlar buluyoruz ve bunları tümörle ilişkisi belirsiz şeklinde rapor ediyoruz. Shashikant Kulkarni: Halen somatik varyant sınıflandırmasına yönelik bir kılavuz bulunmamaktadır. Tümöre özgü olarak mevcut ACMG kılavuzlarını modifiye ederek kullanıyoruz. Lynn Bry: Klinik olarak patojen belirleme, tedavi duyarlılığı ya da direncinin önceden belirlenmesi ve toksin üretimi üzerine odaklanmış durumdayız. Araştırma alanında ise mikroorganizma topluluklarının yapısı, hastalıklarda konakçıda ortaya çıkan değişiklikler, gen içeriğindeki değişiklikler ve metabolitlerle bağlantısını değerlendirecek sıralama yöntemleri kullanılmaktadır. Araştırmaların amacı mikroorganizmaların hastalık oluşturma mekanizmalarının belirlenmesidir. Buradan elde edilecek bilgiler bu tür yöntemlerin klinik kullanıma girip giremeyeceğini de belirleyecektir. Ancak henüz çok başlangıçta olduğumuzdan klinik bildirimin naıl yapılacağını henüz bilmiyoruz. Tesadüfi bulgular: ACMG test edilme nedeni ile ilişkisi olsun olmasın tesadüfen saptanan “etkili olabilecek” patojenik varyantların bir listesini sunmaktadır. 6: Laboratuvarınızın tesadüfen bir varyant saptandığında izlediği yol nedir? Bu tür varyantları özellikle arıyor musunuz? Bu tesadüfi bulguların (IF) bildirimini nasıl yapıyorsunuz? ACMG önerileri doğrultusunda mı hareket ediyorsunuz? Sherri Bale: WES sürecini tamamladığımız, bilinen ve beklenen patojen varyantları belirlediğimiz hastalarda, hasta aksi bir talepte bulunmadığı sürece, ACMG önerileri ve gen listesi doğrultusunda hareket ediyoruz. WES analizinin bir parçası olarak aile bireyleri de tarandıysa ve bu tarama sırasında indeks olgu ile bir aile bireyinde IF saptandıysa, bunu da bildiriyoruz. Ancak indeks olguda bulunmayan bir IF için tüm aile bireylerinde tarama yapmıyoruz. Jill Hagenkord: Hekimle hasta hangi ve ne miktarda koruyucu bilgi istedikleri konusunda ortak karar vermelidir. Tümü ya da hiçbiri yerine neleri öğrenmek istediklerini seçebilmelidirler. Koruyucu genlerdeki patolojik varyantları araştırmakta kullanılan genel yaklaşım ClinVar ya da İnsan Gen Mutasyonu Veri Tabanı (HGMD) gibi referanslardan yararlanmaktır. Eğer gerçekten patojen olduğu bildirilmişse, sınıflandırmaya uygun olup olmadığı ve laboratuvarın kendi patojen kriterlerini karşılayıp karşılamadığına yönelik dikkatli bir değerlendirme yapılmalıdır. Bu amaçla kullanılabilecek yazılımlar mevcuttur. ACMG önerilerinin dışında kalan faktör V Leiden, HFE (hemokromatozis) ve otozomal resesif bozukluklarda sık görülen varyantlar (CFTR [kistik fibrozis transmembran iletim düzenleyici (ATP bağlayıcı kaset alt aile C, üye 7)] gen içindeki ACOG varyantları) gibi durumlarda bir varyant listesi üzerinden koruma taraması gerçekleştirilebilir. Glenn Palomaki: Bu soru anne plazmasının hücre bulundurmayan (ccf) bölümünde DNA testi uygulayan laboratuvarlarla pek ilgili olmamakla birlikte, doğum öncesi taramalarda tesadüfi bulgularla karşılaşılması gittikçe daha sık görülen bir durumdur. Biyoinformatik iletim hatlarında küçük farklılıklar oluşturarak daha önceki tarama teknolojileri ile rastlanmayan bulgular saptanabilir. ABD’de bulunan dört laboratuvar cinsiyet genlerindeki anöploidiyi rutin tarama testlerine eklemiştir. Ancak bu konuda yayınlanan klinik geçerlilik çalışması azdır ve olası yarar ve zararlar ile ilgili tartışmalar devam etmektedir. En yeni tarama hedefi 22p11 (DiGeorge) sendromu gibi daha geniş mikrodelesyonlardır, ancak testin performansına ilişkin özellikle genel popülasyonda yapılmış tarafsız yayın yoktur. Bu sendromla ilgili bilgilerimizin büyük bölümü doğumsal kalp hastalığı gibi anormal bulguları bulunan hasta ya da hasta gruplarından gelmektedir. Bozukluğun doğal seyrinin iyi bilindiği Down sendromu gibi testlerin aksine, 22p11 sendromunun toplumdaki prevalansı ile ilgili bir yayın bulunmamaktadır. Bu nedenle, bu genotipe sahip bireylerin bilinmeyen bir bölümünün önemsiz bir fenotipe sahip olması mümkündür. Bütün genom/ekzoma yönelik inceleme yapan laboratuvarlar hangi bulguları bildirip, hangilerini bildirmeyeceği üzerinde kafa yormalıdır. Richard Press ve Carol Beadling: Tesadüfi bulguların bildirimine yönelik ACMG önerilerinde tümör örnekleri yer almamakla birlikte, panellerimizdeki genlerin çoğu bildirilmesi zorunlu olanlar listesindedir. Kanser numunelerinde saptanan bazı mutasyonlar germ hattında bulunabilir, bunların az sayıdaki bazı varyantları da onkolojik açıdan patojen olabilir. Saptadığımız varyantların germ hattı özellikleri ile ilgili (veri tabanı, alel sıklığı, tedavi sonrası direnç) bazı dolaylı bilgiler veriyor olsak ta, doğrudan yaklaşım olan her hastanın tümör dışı örneği ile eşleştirerek genotipleme yapılması bizim laboratuvarımızda rutin bir uygulama değildir. Nadiren germ hattı olan bir patojen mutasyon saptadığımızda, raporu yazan patoloğun tercihine göre genetik danışmanlık veya germ hattı analizini bir öneri olarak sunuyoruz. Bu konuda ACMG önerilerinden farklı bir noktadayız; bir laboratuvarın tesadüfen saptadığı genetik anormalliklerin hepsini, hele de hastayı gönderen hekim tarafından özellikle kanser bağlantısı açısından değerlendirme istenmiş ve saptanan germ hattı mutasyonu kanser ile ilişkili değilse, bildirmek zorunda olmadığını düşünüyoruz. Shashikant Kulkarni: Nadiren bir hastada ya da aile bireylerinden birinde etkilenmemiş bir germ hattı numunesini incelerken kanser potansiyeli gözlemleyebiliyoruz. Klinik geçerlilik/kullanım: Klinik laboratuvarlar geçerli olduğu gösterilmiş testleri (yani, hastalıkla ilişkili olan gen) sunmakla yükümlüdür. Ancak hizmeti satın alanlar kullanılabilirliği bilinenlerle ilgilidirler. 7: Klinik laboratuvarlar genomik sıralama testlerinin geçerli olduğundan nasıl emin olmaktadır? Klinik laboratuvarlar bir testin klinik kullanımı konusunda başkalarına nasıl yardımcı olabilir? Geri ödeme konusunda iyileşmeler sağlanmasına yönelik önerileriniz neler? Sherri Bale: Klinik laboratuvarlar hizmeti satın alanlara sundukları hizmetlerin klinik kullanımı ile ilgili veriler sunmaya hazırlıklı olmalıdır. Bunlar arasında farklı hasta/veri grupları kullanılarak yapılmış ve ciddi dergilerde yayınlanmış makaleler yer almalıdır. Hizmeti satın alanlar bu testlerin geliştirme, geçerliliğini belirleme, uygulama, yorumlama ve bildirim maliyetleri hakkında bilgi sahibi olmalıdır. Eğer mümkünse, hizmet talep edenin ödemesini karşılayan kurumdan bir yetkili laboratuvara davet edilerek bu testlerin nasıl yapıldığını görmesi sağlanabilir. Jill Hagenkord: Klinik kullanılabilirlik taraflara farklı anlamlar ifade eder. Ödeyenler testin tedavilerini değiştirip değiştirmeyeceği ile ilgilenirler. Ancak kalıtsal hastalıklarda kullanılabilirlik olgudan olguya değişiklik gösterir. Farklı nedenlerle belli zamanlarda belli genleri inceleriz; bu nedenle özgün bir genin klinik kullanılabilirliği ile ilgili her duruma uyan bir cevap yoktur. Genetik bozuklukların çoğu için bir tedavi söz konusu değildir. Gene de doğru tanıya ulaşmanın, hastalığın seyrinin ne olacağını bilmenin, risk altındaki aile bireylerinin de incelenmesinin sağlanmasının, gelecek gebeliklerdeki riskin belirlenmesinin ve olası önleyici önlemlerin ortaya konmasının bir değeri vardır. Hizmeti satın alanlar bu bilgilerin klinik kullanım kriterlerini karşıladığı konusunda aynı fikirde olmayabilir; ancak hem hastalar, hem de yakınları hakkında önemli veriler sağlanacağı açıktır. Moleküler CPT (mevcut işlem terminolojisi) kodları artık özgün ve şeffaftır ve hastalar kendi klinik kullanılabilirlik kriterlerine uymadığı için kalıtsal hastalık testleri için ödeme yapmayı gittikçe daha yüksek oranda reddetmektedir. Geri ödeme konusunda sorunlarla karşılaşılması bilgi erişiminde tüketici tarafından tetiklenen yeni bir eğilime ortam oluşturabilir. Bu durum taksi endüstrisinde Uber ya da Lyft’in yaptıkları ile benzerlik gösterir. Kişisel genetik bilgileri “Uber-izasyonu” bireylerin daha iyi, daha hızlı ve daha ucuz bir şekilde bazı verilere ulaşmasını sağlar. Sıralama testlerinin maliyetlerinin düşmesi ile beraber zamanla hastaların kendi genetik bilgilerine erişimi ve sağlık hizmeti sunanlarla paylaşması mümkün olabilecektir. Böylece klinik kullanılabilirlik konusunda hastalarla sağlık hizmeti ödeme kaynakları arasında bulunan gerginlik azaltılabilir. Richard Press ve Carol Beadling: Tümör temelli mutasyon profilinin çıkarılmasının gerek doğrudan tedavi için bilgi vererek, gerekse tanısal ya da prognostik kategorileri belirleyerek klinik yarar sağladığı hususunda yeteri kadar yayın ve fikir birliği vardır. Bu mutasyonların (ve bu mutasyonları hedefleyen tedavilerin) sayısı hızla arttığından, mutasyon profilinin hastaya yarar sağlayıp sağlamadığı konusunda bir şüphe yoktur; kesinlikle vardır. Karar verilmesi gereken hangi yöntemler kullanılarak ne kadar genin değerlendirmeye alınacağı konusudur. NGS aynı zamanda çok sayıda genin yalnızca az sayıda genin değerlendirilmesiyle karşılaştırılabilir maliyetlerle incelenmesine olanak sağlamakta, böylece daha düşük maliyetle daha fazla bilgi elde edilmesini mümkün kılmaktadır. NGS yardımıyla daha fazla sayıda genin incelenmesi hem tek testle saptanamayacak, nadir görülen ve klinikle bağlantılı varyantların belirlenmesini, hem de tedaviyi yönlendirebilecek ya da hastanın moleküler hedef çalışmalarına alınmasına yol açacak ilaç direnç ya da duyarlılıklarının anlaşılmasını sağlayacaktır. Çerçeveyi tedaviyi etkileyebilecek nadir varyantların da saptanmasını sağlayacak kadar geniş tutmak önemlidir. Bu varyantlar bir arada toplam olguların hatırı sayılır bir bölümünü oluşturur. Çok sayıda tek gen testi uygulamaktansa, belli bir tümör için NGS aracılığı ile geniş bir aralıkta tarama yapmak ve iletim hatları filtrelerinden yararlanarak yalnızca klinik açıdan bağlantılı olan genleri belirlemek, hem tıbbi, hem de mali açıdan daha akılcıdır. Tümör mutasyon profilinin böyle geniş kapsamlı bir tarama ile belirlenmesi, hangi doku tipinden köken alırsa alsın tüm tümörler için tümöre özgü analiz iletim hattı ile aynı NGS ıslak kimya yönteminin kullanılmasına olanak sağlar. Belli bir tümör türü için özgün bir mutasyon görülme sıklığının düşük olduğu göz önüne alınırsa, ödeme kararı verilmeden önce binlerce gen/kanser senaryosunun her biri için anlamlı klinik veri sağlanıp sağlanamayacağını, dolayısıyla maliyete değip değmeyeceğini bilmek mümkün değildir. Ödeme kararı vereceklerin belli bir tümör türü ile ilişkisi bulunması şart olmadan kanserle gen mutasyonları arasındaki bağıntı hakkındaki verilerin çeşitliliğine katkıda bulunulmasına izin vermeleri gereklidir. Shashikant Kulkarni: Testin klinik geçerliliği ve kullanımının iyi anlaşıldığından emin olmak için ödeme yapanların doğru bir şekilde bilgilendirilmesi önemlidir. Bu hedefe yönelik olarak profesyonel topluluklar tarafından oluşturulmuş kılavuzlardan ve özellikle de NGS incelemesinin maliyet etkinliği ve hastalarda sağladığı sonuçlar üzerine odaklanan güvenilir dergilerde yer almış yayınlardan yararlanılabilir. Lynn Bry: Testi yapmak ve sonuçlara göre hangi tıbbi eylemlerin yerine getirileceğini belirlemek için bariz bir klinik nedenimizin olması gereklidir. Enfeksiyöz hastalıklara yönelik testlere en bilinen örnek olarak Sanger sıralaması ile viral geçiş genotiplemesi verilebilir. Klinik endikasyon belirgindir. Dahası NGS yöntemi direnç belirleme duyarlılığını ve verimliliği arttırır ve en azından muhtemelen maliyetleri düşürür. Patojenleri saptama konusunda NGS kararı vermeden önce mevcut yöntemler gözden geçirilmelidir. Eğer aynı bilgi daha hızlı sonuç veren ve daha ucuz olan başka bir mikrobiyolojik ya da moleküler yöntemden sağlanabiliyorsa, ödeme yapan bir genom incelemesinin ağır maliyetini karşılamak istemeyebilir. Patojen genom ya da çoklu hedef sıralaması Mycobacteria gibi yavaş üreme gösteren ya da çok sayıda farklı patojenin bulunduğu numuneler için kullanılmalıdır. Patojen genom sıralamasının yararlarını enfeksiyon kontrol çabaları sürecinde gördük, ancak bu tür testler geri ödemeden yararlanmamaktadır. Gene de bu yöntemin sürveyans belirlenmesi ve enfeksiyon kontrol amacıyla kullanılması yararlarının ortaya konması açısından önderlik sağlayacaktır. Klinisyenlerin ve hastaların yeni teknolojiyi kabullenmesi 8: Bu testler hakkında klinisyenler ve hastalardan ne gibi geri bildirimler alıyorsunuz? Sizce yöntem çok abartılıyor mu, yoksa genom sıralaması beklentileri karşılıyor, hatta aşıyor mu? Sherri Bale: Pazarlama hedef kitlemiz literatürde haklı bir üne sahip genetikçiler. Onların da NextGen hedeflenmiş gen panelleri ya da WES aracılığı ile elde edilen bilgilerden dolayı hayal kırıklığına uğradığını düşünmüyorum. Jill Hagenkord: Genetik alanı dışındaki uzmanlar genomla ilgili gerçekte olduğundan daha fazla bilgiye sahip olduğumuzu düşünüyor olabilir. Beklenti sınırlarını oluşturmak klinik ve laboratuvarlarda çalışan genetikçilerin sorumluluğundadır. Hastalığa özgü gen panelleri ya da ekzomları talep eden hekimler tekrarlanan testlere göre daha çabuk yanıt alacaklarının, ancak aldıkları yanıtın başlangıçtaki ayırıcı tanıda düşündüklerinden çok da farklı olmayacağının bilincindedir. Fazladan VUS ve GUS konusunda bilgi sahibi olacaklardır. Belirsizlik genetik testlere özgü bir sorun değildir. Glenn Palomaki: İlk önceleri ccf DNA testinin girişimsel olmayan doğum öncesi tanı (NIPD) testi olduğu düşünülmüştür. Bu isim daha sonra NIPT (test) ve NIPS (tarama) şeklinde evrilmiştir ve daha fazla karmaşaya neden olmuştur. Çünkü mevcut serum/ultrason tarama yöntemleri de NIPT/NIPS tanımlarını karşılamaktadır. Daha sonra profesyonel kuruluşlar bu yöntemin yalnızca yüksek riskli olduğu belirlenen kadınlarda kullanılmasını önermiştir. Ancak bu yöntem mevcut tarama teknikleri ile değil, girişimsel işlemler veya karyotipleme ile karşılaştırılmıştır. Sahada uygulama yapan hekimler yüksek riskli gebelerde önlenen girişimsel işlemlerin sayısından çok yalancı pozitif sonuçlardan etkilenmiştir. Yöntem eğer genel popülasyonda uygulanabilse, belki de gerçek değerini bulup daha fazla kabullenilecektir. Ancak kuşkusuz yüksek maliyet genel popülasyonda kullanımının önündeki en önemli engeldir. Richard Press ve Carol Beadling: Bu teknoloji biraz abartılıyor olabilir, ancak biz olumlu geri bildirimler alıyoruz. Tümör mutasyon profili çalışmalarımızın bir sonucu olarak pek çok kanser hastası başka türlü erişemeyeceği etkin tedaviler kullanmakta ya da yeni hedeflenmiş tedavi çalışmalarına katılabilmektedir. Bu mutasyonların çoğunun tek gen çalışmalarında rutin olarak araştırılmayan genlerde saptandığının da altını çizmek gerekir. Bu yöntemin bir diğer yararı özellikle miyeloid lösemi hastalarında geleneksel ya da hedeflenmiş tedaviye verilen moleküler yanıtın seri NGS incelemeleri ile belirlenebiliyor olmasıdır. NGS tarafından sağlanan derinlik nedeniyle en düşük düzeydeki hastalık bile büyük bir duyarlılıkla saptanmakta, böylece tedavi seçenekleri hakkında daha kolay karar verilebilmektedir. Shashikant Kulkarni: Klinisyenler, özellikle de medikal onkologlar, tedaviye yanıt vermeyen hastalarda yararlanabilecekleri bir umuda sahip olacakları beklentisi içindedir. Şu an için hastalar ve klinisyenler açısından bu beklenti çok gerçekçi görünmemektedir. Biz laboratuvarcıların en önemli yükümlülüğü bu beklentiyi gerçekçi hale getirmektir. Teknolojik platformları, veri analiz yöntemlerini, belirlenmiş yararlarını ve olası kullanım alanlarını ayrıntılı olarak tarif etmek durumundayız. Son olarak, sıralamanın değerini ve maliyetleri azaltıcı etkisini gösteren verileri bir araya getirmeliyiz. Lynn Bry: On yıldan daha uzun süre önce HIV genotiplemesinin yapılması yüksek aktivitede antiretroviral tedavi (HAART) uygulama gücümüzü büyük ölçüde arttırdı. Sanger temelli yöntemlerle gerçekleştirilmiş olmasına rağmen bu durum hastaların genomik yaklaşımdan nasıl yararlandığını gösteren en iyi örnektir. Enfeksiyon kontrol konusunda patojen genomlarla ilgili yapılan çok merkezli bir araştırmada bulguların ne kadar şaşkınlık yarattığını hatırlıyorum. Böylece mikrobiyal direncin nedenleri hakkında öğrendiklerimizin sürveyans aktivileri ile ilgili ne kadar fazla bilgi sağlayabileceği üzerine düşünmeye başladık. NGS çağında elimizde tanı için kullanabileceğimiz müthiş bir güç bulunduğu kesindir. Alan geliştikçe kullanıma yönelik diyalog devam ettirilmelidir. Yazar Katkıları: Tüm yazarlar bu makalenin bilimsel içeriğine katkıda bulunduklarını ve şu üç gereksinimi yerine getirdiklerini ifade eder: (a) kavram ve tasarıma, verilerin toplanmasına veya analiz edilmesi ve yorumlanmasına anlamlı katkı; (b) makalenin bilimsel içerik açısından hazırlanması ve gözden geçirilmesi; ve (c) yayımlanma için nihai onay. Yazarların Olası Çıkar Çatışması Beyanları: Makalenin gönderilmesi aşamasında tüm yazarlar Olası Çıkar Çatışması Beyan Formu’nu doldurmuştur. Olası çıkar çatışmaları: İstihdam veya Yöneticilik: E. Lyon, Utah Üniversitesi ve Moleküler Patoloji Derneği; F. Cockeril, Mayo Tıbbi laboratuvarları, Quest Diagnostics (1 Ekim 2014) ve misafir editör, Clinical Chemistry, AACC; J. Hagenkord, 23andMe. Danışmanlık: E. Lyon, Complete Genomics and Health Advantages; F. Cockeril, Roche Diagnostics; S. Kulkarni, Swift Biosciences ve Bina Technologies. Hissedarlık: S. Bale, BioReferance Laboratories; J. Hagenkord, Invitae ve 23andMe. Onursal Ücretler: s. Kulkarni, Novartis, affimetrix ve Agilent; R. Press, Life Technologies. Araştırma Desteği: E. Lyon, Ulusal İnsan Genomu Araştırma Enstitüsü kurumsal fonu; L. Bry, NIH; G. Palomaki, Natera, Inc. kurumsal fonu. Uzman Tanıklığı: Bildirilmemiştir. Patentler: Bildirilmemiştir. Diğer Ücretler: F. Cockeril, Roche Diagnostics telif ücretleri.