İndir - Su Ürünleri Merkez Araştırma Enstitüsü Müdürlüğü

T. C.
TARIM ve KÖYİŞLERİ BAKANLIĞI
TARIMSAL ARAŞTIRMALAR GENEL MÜDÜRLÜĞÜ
DENİZ ve AKARSULARDAKİ KİRLİLİĞİN
KARADENİZ'DEKİ EKONOMİK DEĞERİ YÜKSEK
BALIKLARIN STOK ve ÜREMESİ ÜZERİNE OLAN
ETKİSİNİN BELİRLENMESİ
PROJE SONUÇ RAPORU
TAGEM / HAYSÜD /98/12/02/00
Yürütücü Kuruluşlar :
Trabzon Su Ürünleri Merkez Araştırma Enstitüsü
Orta Doğu Teknik Üniversitesi, Biyoloji Bölümü
Prof. Dr. Mesude İŞCAN, Prof. Dr. İnci TOGAN ve İlyas TABAK
(Proje Liderleri)
Dr. Cevdet UĞUZ, Dr. Ayşe ERGÜVEN, Yıldız EROĞLU, Dr. Mustafa ZENGİN
Muammer AKTAŞ ve Bayram ZENGİN
Haziran 2001
ÖZET
Deniz ve Akarsularda Kirliliğin Karadeniz’deki Ekonomik Değeri Yüksek Balıkların
Stok ve Üremesi Üzerine Olan Etkisinin Belirlenmesi
Alkilfenol ethoxylate bileşikleri deterjanlarda, boyalarda, pestisidlerde ve plastik
eşyalarda kullanılan katkı maddeleridir. Bu bileşiklerin dünyadaki toplam üretim miktarının %
60’dan fazlası kanalizasyon ve endüstriyel atıklarla sularda toplanmaktadır. Alkilfenol
bileşikleri sularda alkilfenol türevlerine dönüşmektedir. Bu türevlerin balıklar üzerinde
östrojenik etkileri vardır ve bundan dolayı balıkların hormonal dengesinde ve üremesinde
ciddi bozukluklara neden olmaktadır. Kadmiyum ise balıklar için toksik ve endokrine sistemi
bozucu bir madde olup, endüstriyel atıklarla sulara karışmaktadır. Tatlı ve tuzlu su
balıkçılığımızda önemli bir yer tutan Karadeniz Bölgesine has balık stoklarımızın çevre
kirliliğine bağlı olarak gittikçe azaldığı gözlenmektedir. Araştırmalarımızda, balık stoklarımız
için ciddi bir tehdit oluşturan alkilfenol türevleri ve kadmiyumun, Karadeniz Bölgesindeki
akarsularımızda kirlilik oranları, ekotoksikolojik çalışmalarla belirlenecektir. Bunun için,
kanalizasyon ve endüstriyel atıkların yoğun olduğu Trabzon’daki akarsular ve deniz
kıyılarımızdan, su, sediment ve balık örnekleri alınarak, ODTÜ Biyoloji Bölümü’nde
alkilfenol; Trabzon Su Ürünleri Merkez Araştırma Enstitüsü’nde ise kadmiyumun kirlilik
seviyeleri ölçülecektir. Alkilfenol ölçümünde HPLC ve gaz kromatografileri, kadmiyum
ölçümünde
ise
atomik
absorbsiyon
spektrofotometresi
kullanılacaktır.
Araştırma
bölgelerindeki balık yoğunluğu tespit edilecektir. Balık doku ve organlarında histopatolojik
incelemeler yapılarak, kirliliğin balık sağlığına ve üreme organlarına verdiği tahribat
araştırılacaktır. Sağlanabilecek ek ödeneğe bağlı olarak, balık doku ve organlarındaki enzim
seviyeleri, RFLP, vitellin miktarı ve DNA/RNA oranının tespiti gibi detaylı araştırmalar da
yapılabilecektir.
ANAHTAR KELİMELER: Alkilfenol, kadmiyum, östrojen, ekotoksikoloji, DNA/RNA oranı,
enzim aktivitesi, vitellin
3
ABSTRACT
A Research on the Effects of Sea and Fresh Water Pollution on the Stocks and
Reproduction of Economically Valuable Fishes in the Black Sea Region.
Alkylphenol ethoxylate compounds are used as additive substances of detergents,
paints, pesticides, plastic materials....etc. The production rate of these compounds is over
300,000 tons per year and more than 60% of this amount accumulates in waters via sewerage
and industrial wastes. In water, alkylphenol compounds transform into alkylphenol
derivatives. These derivatives have estrogenic effects on fishes and cause serious
abnormalities in their reproductive and hormonal systems. Cadmium is also toxic for fishes
and it harms their endocrine systems. Cadmium is carried to water by industrial wastes. A
decrease due to water pollution is observed in the population of fishes which are unique to
Black Sea region and vital to both freshwater and sea fishery. Our ecotoxicologic researches
aim to detect the pollution caused by the alkylphenol derivatives and cadmium in the streams
of Black Sea region. Sediment, fish and water samples will be collected from the streams and
coats of Trabzon where sewage and industrial pollution is high. The pollution level of
alkylphenol will be measured at the METU Biology Department whereas that of cadmium will
be measured at Trabzon Fisheries Central Research Institute . HPLC and gas chromotography
will be used for the detection of alkylphenols and atomic absorbtion spectrophotometry will
be used for the detection of cadmium. Fish organs and tissues will be examined in order to
detect harms of pollution on fish health and gonads. More detailed researches such as the
measurements of enzyme levels, RFLP, amount of vitelline and DNA/RNA ratios in fish
organs and tissues will be possible depending on the extra appropriations that might be
provided.
KEYWORDS: alkylphenol, cadmium, estrogene, ecotoxicology, DNA/RNA ratio, enzyme
activity, vitelline
4
2. GİRİŞ
Direkt ve indirekt olarak, denizdeki canlı kaynaklara ve insan sağlığına zarar
verebilecek, balıkçılık dahil denizdeki faaliyetleri engelleyebilecek, deniz suyunun çeşitli
kullanımlar için kalitesini bozabilecek ve zarafetini azaltabilecek her madde ve enerjinin
insanlar tarafından denize verilmesi; deniz kirliliği olarak tanımlanmıştır.
Sularımız, endüstri ve kanalizasyon atıklarıyla gün geçtikçe kirlenmektedir. Çağımızda
hızlı endüstrileşme ve kentleşme, yoğun tarımsal uygulamalar bir çok çevre sorununu da
birlikte getirmektedir.Havası ve suyu kirlenmemiş, toprağı bozulmamış sağlıklı bir çevre 21.
asırda yaşayan insanlığın en büyük isteğidir.
Suların kirlenmesi doğal güzellikleri ve reaksiyon alanlarını bozar, deniz ürünleri için
huzursuz bir ortam yaratır. Kirlenme bilhassa görme, koklama ve dokunma duyularını bozar.
Ülkemizde iç sular ve denizlerdeki su ürünleri stoku günden güne azalmaktadır. Bunun büyük
bir nedeni kirlenmedir. Su kirlenmesi burada yaşayan canlıların üreme ve gelişmelerini
ortadan kaldırmakta, insan sağlığına zararlı olmakta, suların kalitesini bozarak çeşitli amaçla
kullanılmasını zorlaştırmaktadır.
Karadeniz'de kirlenme daha ziyade hızlı kentleşme ve sanayileşmenin görüldüğü
bölgeler etrafında yoğunlaşmaktadır. Bölgemizde bulunan sanayi tesisleri atıkları ve evsel
atıklar arıtma yapılmaksızın denize verilmektedir. Ayrıca tarımsal ilaçlar yağmur sularıyla
derelere ve denizlere karışmakta ve kirlenmeye sebep olmaktadır. Projenin amacı;
Üç tarafı denizlerle çevrili olan ülkemiz, akarsular, irili ufaklı göller ve göletlerle geniş
su ürünleri potansiyeline sahiptir. Bu nedenle su ürünlerini artırma yoluna gidilmelidir.
Ekotoksikolojik araştırmalar gelişmiş ülkelerde çok yaygın ve kapsamlı olarak
yapılmaktadır. Son yıllarda, Avrupa ve Amerika da bilim adamları ve araştırma kurumlarının
üzerinde en çok çalıştıkları konulardan birisi de endokrin sistemi bozucu (endocrin disrupter )
olarak adlandırılan toksik maddelerin çevreye verdiği veya verebileceği tahribatın
araştırılmasıdır. Endokrin sistemi bozucu etkiye sahip bu maddeler, hormon benzeri
olduğundan, canlıların normal fizyolojilerinde hormonal bozukluklara neden olmaktadır.
Balıkların cinsiyetleri hormonlarla çok kolay değiştirilebildiğinden, östrojenik etkiye sahip
alkilfenol gibi maddelerin, balık populasyonlarının devamı ve korunması için ciddi bir tehlike
yaratabileceği düşünülmektedir.
Östrojenik alkilfenol türevleri, sadece dişi populasyonlarının ortaya çıkmasına neden
olarak, balıkların üremesini tamamen durdurabilir vebalık stoklarının kaybolmasına neden
olabilir. Kadmiyumun öldürücü olmayan dozları da balıklardaki aromataz enzimini inhibe
ederek, genetik olarak dişi olan balıklarda östrojen sentezlenmesini durdurup, sadece erkek
populasyonların ortaya çıkmasına neden olabilir ve yine balık stoklarının kaybolmalarına
sebep olabilir. Ayrıca kadmiyumun balıkların üremelerini azaltıcı etkileri de bilinmektedir.
Balık türlerinin insanlar tarafından besin olarak tüketilmesi ve balık yan ürünlerinin
yemlerde sıkça kullanılması yoluyla sonuçta bu zararlı maddelerin insanlara ulaşması
neticesinde bir alkilfenol türevi olan nonilfenolün meme kanserine, kadmiyumun kemiklerin
kolay kırılabilir hal almasına yol açan Itai Itai hastalığına ve immunolojik bozukluklara neden
olduğu bilinmektedir. Bu yönüyle konu insan sağlığı açısından da son derece önemlidir.
2.1. AMAÇ:
Alkilfenol ve kadmiyumun neden olduğu kirlilik saptanacak, bu kirliliğin su ürünlerine
olan biyolojik yansıması belirlenecek ve bu maddelerin canlı organizmadaki etkilerinin
biyokimyasal ve moleküler mekanizmaları açıklığa kavuşturulacaktır. Bu maddelerin
kirliliğine bağlı olarak, üreme organlarında ( testis ve ovaryumlarda ) anormal oluşumlar
görülmesi beklenmektedir. bu değişiklikler ile kirlilik miktarları arasında korelasyon
saptanması, su ürünlerini tehdit eden kirlilik seviyelerinin belirlenmesini sağlayacaktır.
Endokrin sisteme zarar veren bu maddelerin hem çevreye, hem de insan sağlığına
etkilerinin incelenip, bu etkinin ekonomik boyutunun araştırılmasına ve bu zararlı etkilerin
azaltılması için çalışmalar yapılmasına yardımcı olacak bilgiler elde edilecektir.
2.2. KAPSAM:
Bu proje “özet” bölümünde de bahsedildiği gibi, alkilfenol ve kadmiyumun,
balıkçılığımızda en önemli paya sahip Karadeniz Bölgesi’nde gerek deniz ve gerekse akarsu
6
bazında hangi derecede kirlilik yarattığını araştırmak üzere hazırlanmıştır. Bu proje alanında
dünyadaki araştırmalar çok yenidir. Avrupa ve Amerika’da yapılan çalışmalarda, alkilfenol
bileşiklerinin, nehirlerde ve hatta içme sularında birikme oranı ölçülmüştür. Ölçülen miktarlar
mikromolar seviyelerine kadar ulaşmaktadır.Bu konsantrasyondaki alkilfenol bileşikleri
balıklara in vivo ve in vitro koşullarda uygulanıp, etkileri araştırılmıştır. Alkilfenol
bileşiklerinin, alabalıklarda östrojenik bir etkiye sahip olduğu ortaya konmuştur. Ayrıca,
alkilfenol türevi olan nonilfenolün insanlarda meme kanserine yol açtığı elde edilen bulgular
arasındadır. Bu maddelerin insan sağlığını tehdit etmesinden dolayı, alkilfenol türevleri
üzerindeki tıbbi araştırmalar da yoğunluk kazanmaktadır. Ülkemizde bu konuda hiçbir
araştırma yapılmamıştır. Kadmiyum üzerinde ise yurdumuzda ve yurt dışında daha önceden
yapılan araştırmalar vardır. Ancak araştırmalar daha çok, sularda kadmiyumun öldürücü
toksik dozlarının bulunup bulunmadığı yönünde yoğunlaşmıştır. Kadmiyum miktarı eğer
öldürücü toksik dozun altında ise normal kabul edilmiştir. Son zamanlarda yapılan
incelemeler ise, kadmiyumun öldürücü olmayan dozlarının da, su ürünlerini tehdit ettiğini
ortaya koymuştur. Elde edilen bu bilgiler doğrultusunda, adı geçen kirlilik parametrelerinin
belirlenmesi gerekliliği ortaya çıkmış ve Türkiye’de ilk olacak bu çalışma planlanmıştır.
Bu çalışmada sağlanacak ödenek miktarına bağlı olarak önce Trabzon ve civarında
(yakın çevre olması nedeniyle) akarsu ve deniz ortamlarından örnekler (su, sediment, balık)
alınıp, bu örneklerde alkilfenol türevleri ve kadmiyum ölçümleri yapılacak, çıkan sonuçlar
proje çalışmaları sırasında ayrıca yürütülecek olan stok yoğunluğu tespiti çalışmaları
neticesinde elde edilen veriler göz önüne alınarak bir korelasyon saptanması yoluna
gidilecektir.
Bu aşamada kirletilmiş bölgelerdeki yoğun nutrient varlığı nedeni ile stok yoğunluğu
referans olarak seçilen kirletilmemiş bölgelere nazaran büyük çıkabilir. Ancak histopatolojik
çalışmaların sonuçları su ürünlerinin sağlıklı üreme ortamlarının özellikleri konusunda açık
bilgiler vereceğinden, kirliliğe duyarlı ve kirliliğe daha dayanıklı türler üzerinde
gözlenebilecek stok yoğunluğu farklarını baz alarak korelasyon saptamak daha gerçekçi
olacaktır.
Projenin planlanması aşamasında akla gelen ilk sorunlardan biri Türkiye’de ilk kez
çalışılacak olan alkilfenol kirliliğinin doğru örnekleme zamanının seçilmesi idi. Projenin
oldukça ayrıntılı ve hassas analizlere ihtiyaç duyması, hem finansman, hem de personel
açısından yeterli destek bulabilme şartına direkt bağlı olmak kaydıyla, kirlenmenin mevsimsel
7
şartlar nedeni ile ( tarımsal ilaçlamalar, yağış miktarı gibi ) yoğunlaştığı veya azaldığı,
balıkların üreme faaliyetlerinin gerçekleştiği dönemler göz önüne alınarak yılda iki kez
örnekleme yapılması öngörülmüştür. Alınan örneklerin analize hazırlanıp, analizlerin
gerçekleştirilmesi süreleri parametrelere göre farklı ihtiyaçlar göstermektedir. Bazı
parametrelerin 15 gün gibi kısa bir süre içerisinde analizlerinin bitirilmesi gerekliliği ve çok
pahalı materyal sarf edilmesi, çalışılacak örnek sayısı konusunda da kısıtlamaya gidilmesine
yol açmıştır. İstatistik olarak yorum yapabilmek için gerekli asgari örnek sayısına ulaşabilmek
konusunda, çalışmalar başladıktan sonra ortaya çıkabilecek; metodun uygulanabilirliği,
örneklerin zamanında ve uygun koşullarda analiz mahalline ulaştırılması gibi sorunlar da göz
önüne alınarak proje süresinin kısa olduğu söylenebilir. Çalışmanın Türkiye’de ilk kez
yapılacağı düşünüldüğünde, hesaplanamayan başka sorunların varlığını da kabul ederek bu
sürenin sonunda böyle bir çalışmanın eldeki imkanlarla ne dereceye kadar başarılabileceği
konusunda fikir sahibi olmayı beklemekteyiz. Edinilecek tecrübelerin ışığında, ileride daha
büyük finansman bulunduğu takdirde, proje süresi uzatılarak kapsam ve çalışma sahası
genişletilebilir.
8
3. LİTERATÜR ÖZETİ
Bu proje kapsamındaki araştırmalar dünyada çok yenidir. Özellikle endokrin sistemi
bozucu maddeler olarak adlandırılan alkil fenol bileşiklerinin etkilerinin araştırılması, Amerika
ve Avrupa da 1990’larda hız kazanmıştır. Sularda bu maddelerin ölçümleri, 0ngiltere ve ABD de
yapılmıştır. Bu konuda en fazla çalışma İngiltere den Susan Jobling, John Sumpter ve
arkadaşlarına aittir. Jobling, Sumpter ve arkadaşları, gerek in vitro gerekse in vivo yaptığı
çalışmalarda, alkilfenol bileşiklerinin balıklar üzerinde östrojenik bir etkiye sahip olduğunu
bulmuşlardır.
Alkilfenol bileşiklerinin insan sağlığı için de bir tehdit olduğu yapılan tıbbi araştırmalarla
ortaya konmuştur. Tıp alanında bir bilimsel dergi olan Environmental Health Perspective
dergisinin 103. sayısı (suppl.7), tümüyle endokrin sistemi bozucu maddeler üzerinde yapılan
araştırmalara ayrılmıştır. Bu maddeler arasında alkilfenol bileşikleri çok önemli bir yer
tutmaktadır. Kadmiyum üzerinde yapılan araştırmalar çok daha eski olmakla birlikte,
kadmiyumun endokrin sistemi bozucu etkiye sahip olduğuna ilişkin araştırmalar yenidir.
Karadeniz'in Türkiye kıyılarında bulunan, evsel ve sanayi atıklarının deşarj bölgelerinde
daha önceden yapılmış bir çalışma bulunmadığı için bir karşılaştırma yapmak mümkün
olmamaktadır. Fakat Karadeniz'e kıyısı olan ülkelerin yapmış oldukları çalışmalar şunlardır;
Romanya'nın 1982-1985 yıllarında kıyı yüzey sularında yapmış olduğu çalışmalarda bakır
miktarı 0.0006-0.007 mg/L arasında bulunmuştur (31).
FAO 1990 kayıtlarına göre 1983 ve 1984 yıllarında Sakarya Nehrinden alınan su
örneklerinde belirtilen bakır değerleri, her iki senede aynı olmak üzere 0.005-0.05 mg/L arasında
bulunmuştur. Yine aynı kayıtlara göre Tuna nehri sedimenti düşük konsantrasyonlarda ağır metal
içerir. Örneğin; Bakır miktarı 0.005-0.01 mg/L arasındadır (33).
FAO 1990 kayıtlarına göre 1983 ve 1984 yıllarında (10) Sakarya Nehrinde sırasısıyla
1.73 ve 1.74 mg/L ve Yeşilırmak nehrinde sırasıyla 0.213 ve 0.26 mg/L demir tespit edilmiştir.
Yine aynı kayıtlara göre Tuna nehri sedimenti düşük konsantrasyonlarda demir içerir. Demir
miktarı 3-7 mg/L arasındadır.
FAO 1990 kayıtlarına göre (33) Karadeniz'de ortalama inorganik besleyici elementlerden
nitrat azotu 1-10 m derinlikler arasında 0.0008 mg-at/L’dir. Yine aynı kayıtlara göre Sakarya
Nehrinde yapılan ölçümlerde nitrat azotu miktarı 1983-1984 yıllarında 1.14 mg/L olarak
bulunmuştur. Yeşilırmak’ta 1984 yılında yapılan ölçümlerde nitrat azotu 0.53 mg/L olarak
bulunmuştur. Kızılırmak’ta 1983 yılında yapılan ölçümlerde nitrat azotu 1.69 mg/L, 1984 yılında
ise 7.5 mg/L olarak bulunmuştur. 1952-1977 yılları arasında Dinyester Nehrinin akış hızının
düşük olduğu kısımlardaki nitrat azotu miktarı 0-0.001 mg/L den 0.003-0.4 mg/L'ye
yükselmektedir.
FAO 1990 kayıtlarına göre (33) Karadeniz'de ortalama inorganik besleyici elementlerden
amonyak azotu 1-10 m derinlikler arasında 0.00218 mg-at/L’dir. Yine aynı kayıtlara göre
Sakarya Nehrinde 1983 yılında yapılan analizlerde amonyak azotu 0.45 mg/L, 1984 yılında ise
amonyak azotu 0.43 mg/L olarak bulunmuştur. Yeşilırmak’ta 1983 yılında yapılan ölçümlerde
amonyak azotu miktarı 0.31 mg/L olarak, 1984 yılında ise 0.26 mg/L olarak bulunmuştur.
Kızılırmak’ta 1983 yılında yapılan ölçümlerde amonyak azotu miktarı 0.41 mg/L olarak, 1984
yılında ise 0.49 mg/L olarak bulunmuştur.
FAO 1990 kayıtlarına göre Sakarya Nehrinde 1983 yılında yapılan analizlerde askıdaki
katı madde miktarı 698.3 mg/L, 1984 yılında ise 605 mg/L olarak bulunmuştur. Yeşilırmak’ta
1983 yılında yapılan ölçümlerde askıdaki katı madde miktarı 105 mg/L, 1984 yılında ise 81.66
mg/L olarak bulunmuştur (10). Buradan da anlaşılıyor ki nehirlerin getirdiği askı yük,
Karadeniz'i büyük ölçüde etkilemiştir.
Tuğrul ve arkadaşlarının (35) yaptıkları bir çalışmada Karadeniz’le ilgili olarak nitrat,
fosfat ve hidrojen sülfür (H2S) değerlerinin su yoğunluğuna (t) bağlı düşey dağılımlarını
irdeleyerek, bu parametrelerin derinliğe değil t’ye uyumlu olarak değiştiğini tespit etmişlerdir.
10
4. MATERYAL v e METOD
4.1. MATERYAL
4.1.1. Laboratuar Cihazları
Çalışmada kullanılan laboratuar cihazları ve bu cihazların teknik özellikleri Tablo 1’de
verilmiştir.
Tablo 1. Kullanılan laboratuar cihazları ve özellikleri.
Cihazlar
Su Analiz Cihazı
Refraktometre
Spektrofotometre
Etüv
Vibratör
Arazi Tipi Soğutucu
Santrifüj
Saf Su Cihazı
Manyetik Karıştırıcı
Salinometre
Özellikleri
HORİBA marka U-7 ve U-10 model, elektrometrik yöntem ile anında
fiziksel (sıcaklık, pH, elektriksel iletkenlik, bulanıklık, tuzluluk ve
çözünmüş oksijen) ölçümler yapan arazi tipi dijital göstergeli bir
cihazdır.
Sudaki tuzluluğun anında ölçülmesinde kullanılan bir alettir.
HACH marka DR/2000 model mg/L seviyesinde ölçüm yapan elektrikle ve şarj
pilleriyle çalışabilen, arazi tipi bir cihazdır.
Optik yöntemlerden Spektrofotometrik (moleküler absorpsiyon spektroskopisi)
yöntem ile metallerin belli pH değerlerinde organik reaktiflerle meydana getirdikleri
renkli komplekslerin suda çözünmeyen organik çözücülerle ekstraksiyonundan
sonra, bilinen dalga boylarında spektrofotometrede tayini esasına dayanmaktadır.
Bu cihazla, proje gereği alınan deniz suyu örneklerinde; amonyak
azotu, nitrat azotu, nitrit azotu, fosfat, demir, bakır, klorofil-a, yağ ve
deterjan parametrelerinin miktarları arazide tayin edilmiştir.
ELEKTRO-MAG marka 60-240 C aralığında ısıtma yapan bir
cihazdır.
ELEKTRO-MAG marka tüp karıştırıcısıdır.
ELECTROLUX marka RC 1600 model, elektrikle ve arabanın aküsü
ile çalışabilen arazi tipi bir cihazdır. Sıcaktan ve ışıktan korunması
gereken su örnekleri ile kimyasal çözeltilerin taşınmasında
kullanılmıştır.
HETTİCH marka EBA 3S model bir cihazdır.
KÖTTERMAN marka 1033 model, saatte 7 litre kapasiteli bir
cihazdır.
NÜVE marka MK 218 model, elektrikli manyetik karıştırıcı ve
ısıtıcıdır.
YSI model 33 S-C-T METER, pille çalışan mekanik bir cihazdır.
Sıcaklık, tuzluluk ve iletkenlik ölçmektedir.
4.1.2. Av Araç ve Gereçleri
Akarsu ortamındaki örneklemelerde iki değişik boyutta (5 ve 6.5 m çaplı) ve göz
açıklığında (17 ve 22 mm) serpme ve özellikle küçük derelerde ve yan kollarda daha iyi
performans gösteren Auseng marka, IG.00 Baujahr 11/84 tipinde, 300-400-500-600-800 volt
doğru akım elektrik üretebilen, akım şiddeti dört ayrı kademede ayarlanabilme özelliğinde
olan ve sırtta taşınabilen elektroşok cihazı kullanılmıştır.
Ayrıca örnekleme çalışmalarında 28, 32, 36 ve 40 mm göz açıklıklarına sahip 100’er
metre uzunlukta 8 adet fanyasız, 17, 28 mm göz açıklıklarına sahip 100 m uzunlukta iki adet
fanyalı olmak üzere, değişik özellikte kıyı uzatma ağları kullanılmıştır.
4.2. YÖNTEM
4.2.1. Ölçülen parametreler
Alkilfenoller:
Suda ve sedimentde bulunması muhtemel alkilfenoller destilasyonla alınıp uygun koşullarda
ve uygun kolon kullanılarak HPLC tekniğiyle ölçülecektir.
Kadmiyum: Suda, sedimentde, askıdaki katı maddede, balık karaciğerinde ve balık
gonatlarında bulunan kadmiyum, uygun ekstraksiyon ve çözme yöntemleri kullanılarak belirli
hacme tamamlanmış çözeltiler haline getirilip atomik absorbsiyon spektrofotometresinde
grafit fırın şartlarında ölçümleri yapılacaktır.
Balık yoğunluğu: Akarsu ve deniz ortamında seçilen kirletilmiş ve temiz istasyonlarda CPUE
tekniği kullanılarak tespit edilecektir.
Histopatolojik incelemeler: Balık gonatlarından alınan örnekler cinsiyet ve yaş tespitleri de
yapılarak Bouin’s solusyonunda fix edilip daha sonra etil alkol çözeltisine alındıktan sonra
parafin kullanılarak bloklar halinde dondurulup, mikrotomla kesilip, lamlar üzerine
fixedilerek boyanıp mikroskop altında incelenecektir.
Enzim aktivitesi : Balık kanında.
DNA/RNA oranı : Balık kanında.
12
ÖRNEKLEME ÇALIŞMALARI
Sakarya Nehri Üzerinde Örnekleme
Sakarya nehri üzerinde 5-9 Temmuz 1999 tarihleri arsında, Şekil 1 de görüldüğü gibi 5
istasyondan su, sediman ve balık örnekleri alındı. Örneklemeye, ilk istasyon olarak seçilen,
Seyitgazi, Seyitsuyu deresinden başlandı. İki litre su ve 0,5 kg sediman örneği alındı. Işığın
alkilfenol üzerine olan etkisini ortadan kaldırmak için, örnekler renkli cam şişeler içerisinde
+4ºC’de saklandı. Ayrıca, su ve sediman örneklerinin mikrobiyal bozulmasını önlemek
amacıyla örneklere % 10 oranında formaldehit ilave edildi. Örnekler; alkilfenol ölçümü için
ODTÜ-Biyoloji, Cd++ ölçümü için ise Trabzon Su Ürünleri Merkez Araştırma Enstitüsündeki
laboratuarlara nakledildi.
Şekil 1. Sakarya nehri ve Değirmendere üzerindeki örnekleme istasyonları. S1, Seyitsuyu; S2,
Porsuk Çayı; S3, Sarıcakaya; S4, Pamukova; S5, Karasu on Sakarya River. D1, Su
Ürünleri Yüksek Okulu Önü; D2, Maçka; D3, Esiroğlu; D4, Sanayi Sitesi.
13
Balık örnekleri, dere ve nehirlerden elektroşok yöntemi ile toplandı. Balıkların
karaciğeri ve gonadları ayrıldı. Gonadlar, Bouin’s solüsyonu içerisinde 24 saat fiks edildikten
(sabitleştirildikten) sonra musluk suyu ile yıkanarak % 70 etil alkol içersinde muhafaza edildi.
Karaciğeri ve gonadı ayrılmış balık karkasları ve balık karaciğerleri etiketlenerek ayrı ayrı
kilitli torbalarda sıvı azot içerisinde donduruldu.
Şekil 1’de görüldüğü gibi, örneklemeler aynı yöntemlerle, Sakarya nehrinin aşağı
bölgelerinden, sıra ile Porsuk Çayı, Sarıcakaya, Pamukova ve Karasu’dan yapıldı Yalnızca
Porsuk Çayı’nda balık örneği alınamadı. Örnekleme esnasında suyun pH’sı, çözünmüş oksijen
miktarı (ÇO) ve sıcaklığı ölçüldü (Tablo 2).
Tablo 2. Değirmendere ve Sakarya nehrinde su kalitesine ilişkin parametreler.
Değirmendere
Sakarya nehri
Parametreler
S1
S2
S3
S4
S5
D1
D2
D3
D4
8.68
4.5
8.8
7.6
6.7
9.45
8.34
9.14
7.92
pH
7.43
7.10
7.78
7.86
7.86
7.9
8.02
8.32
8.41
Sıcaklık (ºC)
19.1
19.1
19.7
26
25.5
13.4
22.4
21.9
24.5
Çözünmüş O2
(mg/l)
Değirmendere Üzerinde Örnekleme
Şekil 1 de görüldüğü gibi Değirmenderesi üzerinde 4 istasyondan örnekleme yapıldı.
Sakarya nehri üzerinde yapılan örnekleme yöntemi, Değirmenderesi üzerinde de aynen
tekrarlandı. Örneklemeye, Değirmenderesinin en üst kısımlarından, “Su Ürünleri Yüksek
Okulu” çevresinden başlandı. Daha sonra aşağıya doğru sırasıyla, “Maçka çıkışından”,
“Esiroğlu” ve Değirmenderesinin Karadeniz'e döküldüğü yer olan, “Sanayi Sitesi”
çevresinden su, sediman ve balık örnekleri alındı. Örnekler, daha önce anlatıldığı gibi
muhafaza edildi.
Yukarıda da belirtildiği gibi, örneklerin bir kısmı, alkilfenol ölçümü ve histoloji için
ODTÜ-Biyoloji laboratuarlarına; kadmiyum ölçümü için de Trabzon Su Ürünleri Merkez
Araştırma Enstitüsüne nakledildi. Laboratuarlarda, su ve sediman örnekleri +4C’de, doku
örnekleri ise -22C’de ölçümlerin yapılacağı zamana kadar muhafaza edildi. Su ve sediman
14
örneklerinde alkilfenol ölçümlerine derhal başlandı. Bütün istasyonlardan alınan su ve
sediman örneklerinin hepsinde ölçümler yapıldı.
ALKİLFENOL ÖLÇÜMÜ
Gerekli Materyal
Shimadzu HPLC pompası (model LC-9A), spektrofotometresi (model UV-160A) ve
integratörü (model CR-6A), Luna C18 HPLC (250 x 4.6 mm, 5 l) kolonu, C18 BOND
ELUTE (100 mg/ml) oktadesil silika kartuşu ve HPLC kalitede metanol (Merck)
kullanılmıştır. Ayrıca, alkilfenol türevleri olan 4-tert- bütilfenol, 4-tert- oktilfenol, 4nonilfenol Aldrich firmasından temin edildi ve HPLC’de alkilfenol ölçümü optimizasyonu
için kullanıldı.
HPLC’de Standart Alkilfenol Ölçümü
Standart alkilfenol türevleri etil alkol içerinde çözülerek stok solüsyonlar hazırlandı.
0,2203 gr nonilfenol; 0,206 gr oktilfenol; 0,150 gr bütilfenol; 100 ml etanol içerisinde
çözülerek 10 mM stok solüsyonu hazırlandı. 1, 0.5, 0.1, 0.05 ve 0.05 mM solüsyonlar 10 mM
stok solüsyonunun seyreltilmesi ile elde edildi. Örneğin, 1 mM elde etmek için 10 mM
solüsyondan 100 l alınarak 900 l etanol içerisinde seyreltildi. Etanol içersinde hazırlanan
solüsyonlarda, alkilfenol türevlerini birbirinden ayırmak özellikle oktilfenol ve nonilfenol
bileşiklerini ayırmak mümkün olmadığından, solüsyonlar aynı yöntemle metanol içerisinde
hazırlandı. Metanol içersinde hazırlanan solüsyonlarda nonilfenol ve oktilfenolü birbirinden
ayırmak mümkün hale geldi. Alkilfenol bileşikleri değişik konsantrasyonlarda ölçülerek, her
konsantrasyona denk düşen minimum peak alan değerleri tespit edildi.
Lineer regresyon hesabı yapılmıştır ve regresyon eşitliği; bütilfenol için Y=76.864672 +
58042.792x; nonilfenol için Y=-370 + 53238.305x; oktilfenol için Y=-545.0445293815x.
Regresyon eşitlikleri istatisksel olarak anlamlıdır (p<0.01). Doku, sediman ve sularda ölçülen
nonilfenol peak alanları, bu eşitlikteki X yerine yazılarak işlem yapıldığında, mM cinsinden
alkilfenol miktarı bulunacaktır.
Standart alkilfenol ölçümler için Luna C18 (İSOKRATİK) HPLC (4,6x250 mm, 5 µL)
kolonu ile normal faz ve isokratik HPLC yöntemi kullanıldı (Ahel ve Giger, 1985). Solid ve
polar olmayan faz oktadesil silika sıvı ve polar faz olarak da % 100 HPLC kalitede metanol
15
kullanıldı. HPLC’de 0.2 ml/min akış hızında, değişik konsantrasyonlarda hazırlanan
nonilfenol, oktilfenol ve bütilfenol standart çözeltileri kullanılarak, ölçüm koşulları optimize
edildi (Ahel ve Giger, 1985; Marcomini ve arkadaşları, 1987)). Standart çözeltilerden ve
özütleme (ekstraksiyon) işlemi tamamlanan, su ve sediman, ve doku örneklerinden HPLC'ye
25 l yüklenerek ölçümler yapıldı.
Tablo 3. Standart alkilfenol konsantrasyonlarına göre HPLC’de okunan peak değerleri
Standart alkilfenol türevlerinin HPLC’de verdikleri Peak değerleri
Concent.
Bütilfenol
(mM)
Nonilfenol
peak alanı
g/ml
meanSE
Oktilfenol
peak alanı
g/ml
meanSE
n=2
g/ml
n=2
API
peak alanı
peak alanı
meanSE
meanSE
n=2
n=2
1
150
57757168
220
52330156
206
93127110
2130360
0.5
75
29848197
110
27356455
103
46570427
10033115
0.1
15
5933433
22
5006296
20.6
9508186
2139294
0.05
7.5
272289
11
2060256
10.3
3795205
8168.48
0.025
3.75
13469
5.5
56938.8
5.15
1416118
48234
Şekil 2, 3, 4, ve 5’te, standart alkilfenol türevleri olan nonilfenol (NP) ve oktilfenol
(OP)’nin, C18 oktadesil silika kolonundan tutulma zamanları 17, 23 ve 24 dakikadır.
Bütilfenolün HPLC’de verdiği peak ve kolonda tutulma zaman şekil 3’de, nonilfenolün Şekil
4’de ve okilfenolün ise Şekil 5 de görülmektedir. Bütilfenol, nonilfenol ve oktilfenol metanol
içerisende çözünerek elde edilen karışımının HPL analizi ise Şekil 6 da görülmektedir. Şekil
6’da görüldüğü gibi nonilfenol ve oktilfenolün tutulma zamanı 23 ve 24. dakikada
örtüşmektedir. Nonilfenol, oktilfenolden yaklaşık 30 saniye daha geç çıkmaktadır (Şekil 6).
Ayrıca, standart alkilfenol türevlerinin ayrı ayrı ve birlikte ölçümlerinde görülen ve tutulma
zamanı 37 dakika olan bir peak daha vardır ve bu peak alkilfenol ilintili indikatör olarak
adlandırılmıştır (Şekil 2-5).
16
Şekil 2. HPLC’de bütilfenol peaki. İsokratik ve normal faz HPLC yöntemi ile 0.5 mM
(75g/ml) standart 4-tert-butilfenol analizi. BP, butilfenol; API, alkylphenol ilintili
indikatör.
Şekil 3. HPLC’de nonilfenol peaki. İsokratik ve normal faz HPLC yöntemi ile 0.5 mM (110
g/ml) standart 4-nonilfenol analizi. NP, nonylphenol; API, alkylphenol ilintili
indikatör
Şekil 4. HPLC’deki Oktilfenol peaki. İsokratik ve normal faz HPLC’de 0.5 mM (103 g/ml)
standart 4-tert-oktilfenol analizi. OP, octylphenol; API, alkylphenol ilintili indikatör.
17
Şekil 5. Standart alkilfenol türevleri olan bütil, nonil ve oktilfenollerin HPLC’de verdikleri
peakler. 75 g/ml bütilfenol (BP); 110 g/ml nonilfenol (NP); 103 g/ml oktilfenol
(OP)’ün metanol içinde çözülmesinden sonra isokratik ve normal faz HPLC
yöntemi ile ölçülmesi. API, alkilfenol ilintili indikatör.
Alkilfenol türevleri olan bütil-, nonil- ve oktilfenol standartları HPLC’de ölçüldüğü
zaman, 34-35. dakikalarda bir peak daha görülmektedir. Bu peak, alkilfenol türevleri
HPLC’ye ayrı ayrı yüklendiği zamanda da 34-35. dakikalarda görülmektedir. Bu peak’in
etoksi ünitesi olduğu tahmin edilmektedir.
Sularda Alkilfenol Özütlemesi
Ölçüm için alkilfenol bileşiklerinin su örneklerinden özütlenip, HPLC çözücüsü
içerisinde çözünebilir hale getirilmesi gerekmektedir. Bu nedenle, su örnekleri, C18 BOND
ELUTE kartuşlarından filtre edildi. Su içerisinde bulunan, alkilfenol bileşikleri C18 kartuşlar
içindeki oktadesil silika tarafından tutulmaktadır. Oktadesil silika tarafından tutulan alkilfenol
bileşikleri metanol ile yıkandığı zaman, kartuşlardan serbest kalıp, metanol içerisine
geçmektedir (Marcomini ve arkadaşları, 1987). Böylece, alkilfenol bileşikleri sulardan C18
BOND ELUT kartuşu ile ayrılıp, metanol içerisinde toplanarak ölçülecek hale getirilmektedir.
Deiyonize su örneğine eklenen standart alkilfenol konsantrasyonları, istenilen oranda
konsantre edilerek ölçülebilmektedir. Örneğin, 100 ml deiyonize su örneğindeki 10 M
alkilfenol konsantrasyonu, C18 BOND ELUT kartuşundan geçirildikten sonra, kartuş 10 ml
18
metanol ile yıkanarak 10 defa konsantre edilmiş oldu. Böylece, deiyonize su içerisine konan
10 µm, yukarıda tarif edilen yöntemle 10 defa konsantre edilerek 100 µM konsantrasyona
ulaşılmaktadır. C18 BOND ELUT kartuşu ile deiyonize sudan alkilfenolleri konsantre etme
işlemindeki duyarlılık oranı oktilfenol ve nonilfenol için bütilfenolden daha fazladır (Şekil 6).
Şekil 6. Su örneklerinden özütlenen standart bütil, oktil, ve nonilfenolün HPLC’de verdiği
peakler. BP, bütilfenol; NP, nonilfenol; OP, oktilfenol.
Su örneklerinden 100 ml alınarak C18 BOND ELUT kartuşundan filtre edildi ve 10 ml
metanol ile kartuş yıkanarak ekstraktsiyon (özütleme) yapıldı ve HPLC’de metanol içindeki
alkilfenol miktarı ölçüldü. Su örneklerinden alkilfenollerin ekstrakte edilebilirliğini test etmek
için, 100 ml su örneğine 10 M alkilfenol türevi eklendi ve C18 BOND ELUT kartuşundan
geçirildi. Daha sonra kartuş, 10 ml metanol ile yıkanarak, su örneğine konan 10 M, 10 defa
konsantre edildi. Ancak, Sakarya nehri ve Değirmenderesinden alınan su örneklerinde,
konsantre etme ya da suya konulan alkilfenol miktarını tekrar ekstrakte etme işlemi, deiyonize
sudan ekstrakte etme işlemine oranla daha az duyarlı bulundu. C18 BOND ELUT ile sulardan
alkilfenol ekstraksiyondan işleminden sonra, 100 M olması gereken konsantrasyonunun daha
19
düşük olduğu görülmektedir. Bu da elimizdeki sistemin sulardan alkilfenol ölçme de çok
hassas bir sistem olmadığını göstermektedir. Sularda ve sedimanlardaki alkilfenol özütleme
verimi Tablo 4’de gösterilmektedir.
Tablo 4. Sakarya nehri ve Değirmendere Nehri Üzerinde alınan su ve sediman örneklerindeki
alkilfenol özütleme verimi
Su Örnekleri
Alkylphenols
mean
n=9
Sediman Örnekleri
stdev
% CV
mean
n=9
stdev
% CV
Bütlilfenol
73.55
22.79
31
29.33
18.93
65
Nonilfenol
57
17.26
31
51.5
25.8
50
Oktilfenol
63.11
19.29
31
32.8
10.31
31
Sedimanlarda Alkilfenol Özütlemesi
Sedimanlarda alkilfenol ölçümü için 50gr sediman tartıldı ve 25 ml metanol ile yıkandı.
Daha sonra metanol süspansiyonu filtre kağıdından süzüldü. Böylece sediman içersinde
bulunan alkilfenol bileşikleri metanol içerisinde, süzüntüde toplandı.
Sediman örneklerinde, alkilfenollerin özütlenebilirliğini test etmek için, ölçümlerde kullanılan
örneklerle aynı miktarlarda sediman örneği alınarak, içerisine bilinen konsantrasyonlarda
alkilfenol bileşikleri eklendi ve aynı yöntemle ekstrakte (özütlenerek) edilerek, ölçümlerde
pozitif kontrol olarak kullanıldı. Örneğin, 50 gr sediman örneğine 500 l (final konsantrasyon
200 M) alkilfenol türevleri eklendi ve 25 ml metanol ile karıştırılarak, filtre kağıdından
süzüldü ve pozitif kontrol olarak alkilfenol ölçümü yapıldı. Pozitif kontrol olarak kullanılmak
için toprağa eklenen alkilfenol türevlerinin tekrar ekstrakte edilmesindeki duyarlılık oranı
%100’dür. Ancak, Sakarya nehri ve Değirmenderesi üzerinde toplanan sediman örneklerinden
20
ekstrakte işlemi esnasında, duyarlılık örnekleme istasyonlarına göre değişmektedir.
Sedimanlardaki özütleme verimi Tablo 3’de gösterilmektedir.
Dokularda Alkilfenol Özütlemesi
Bu çalışmada, Zhao ve arkadaşlarının (1999) geliştirdiği tekniğe benzer bir teknik
geliştirildi. Balıklar örneklendikten sonra, karaciğerleri ayrıldı. Karaciğerleri ayrılan balıkların
bütün dokuları, dondurularak –22 ºC’de ölçüm zamanına kadar saklandı. Karaciğerler, enzim
çalışmaları için sıvı azot içinde dondurulduktan sonra -80ºC’de muhafaza edildi. Alkilfenol
ölçümü için, dondurulmuş balık dokuları havanda ezilerek toz haline getirildi. Bu işlem
esnasında, donmuş dokuların erimemesi için sürekli sıvı azot eklendi. Dokular toz gibi ince
ezilip homojenize edildikten sonra, metanol ile iyice karıştırılarak yıkandı. Metanol doku
karışımından 1.5 ml alındı ve 12,000g’de 15 dakika santrifüj edilerek, HPLC’de ölçülecek
konuma getirildi.
Alkilfenol ölçümü, laboratuar koşullarında deney yapılan gökkuşağı alabalığı
(Ochorynchus mykiss), ve doğadan toplanan siraz balıklarının dokularında yapıldı.
Histoloji
Gerekli Materyal
Etil alkol, asetik asit, pikrik asit, formaldehit, parafin, HCl, Ksilene, yatay şala, lam
sepeti, lam, lamel, parafin dondurma kalıbı, parafin dondurma yüksüğü, parafin eritme ve
dökme kabı, mikrotom ve mikroskop.
Histolojik Doku Hazırlama Yöntemi
Yukarıda da bahsedildiği gibi balık gonadları Bouin’s solüsyonu içerisinde 24 saat
sabitleştirildi ve sonra normal musluk suyu ile yıkanarak % 70 etil alkol içerisinde muhafaza
edildi. Dokuların histolojik incelenmesinde rutin olarak kullanılan, dokuların parafin bloklar
21
içerisinde dondurulma işlemi yapıldı. Parafin içinde dondurulmuş, dokular, Mikrotom ile 5
m kalınlığında kesildi ve hematoksilen-eozin boyama yöntemi ile boyanarak normal ışık
mikroskobu altında incelendi.
SAKARYA NEHRİ VE DEĞİRMENDERE ÜZERİNDE YAPILAN ÖLÇÜMLER
Su ve Sediman Örneklerindeki Alkilfenol Kirliliği
Sakarya nehrinden ve Trabzon, Değirmenderesinden alınan su örneklerinde alkilfenol
türevlerine rastlanmamıştır. Bu da göstermektedir ki, alkilfenol bileşikleri, hidrofobik
özelliklerinden dolayı ölçülebilecek miktarlarda bulunmamaktadır. Naylor ve arkadaşları
1992’de; Ahel ve arkadaşları 1994’de, alkilfenollerin sularda değil sediman ve suda yaşayan
canlılarda biriktiğini rapor etmektedirler. Tablo 3’de gösterilen özütleme verimi göz önüne
alındığında, sularda bulunabilecek alkilfenol miktarları Tablo 4’de gösterilmiştir. Sakarya
nehrinde hem de Değirmenderesinde iki örnekleme istasyonunda alkilfenol türevlerine
rastlanmıştır Tablo 4. Sakaya Nehri üzerinde, Porsuk Çayı’ndan alınan sediman örneğinde
3.15 g/g bütilfenol ölçülmüştür. Değirmenderesi üzerinde, Maçka’dan alınan sediman
örneğinde ise 1.68g/g bütilfenol ile 4.46 g/gr nonilfenol ölçülmüştür. Ayrıca, Tablo 3’de
gösterilen özütleme verimi göz önüne alınarak sedimanlarda hesaplanan alkilfenol değerleri
Tablo 4’de gösterilmektedir. Alkilfenol türevlerine rastlanan istasyonlarda Klorofil-a ve
çözünmüş oksijen seviyesi de diğer istasyonlara göre daha düşük bulunmuştur. Ancak, iki
istasyonda Klorofil-a ve çözünmüş oksijen çok düşük miktarlarda çıkmasına rağmen,
alkilfenol türevlerine rastlanmadı. Bu iki istasyonda, sediman yani çamur alınamadığından ve
kum alınmak zorunda kalınmıştır. Değirmenderesi, Sanayi Sitesinde, kanalizasyon atıklarının
denize boşaltıldığı noktadan yapılan örnekleme de çamur örneği elde edilememiştir.
Değirmenderesi ve Sakarya Nehri üzerinden Toplanan Balıklardaki Alkilfenol Seviyesi
Su ve sediman örnekleri toplanan bütün istasyonlarda-Porsuk Çayı hariç- toplanan balık
örnekleri de toplanmıştır. Porsuk Çayı’nda balık yakalanamamıştır. Değirmenderesi, birinci
istasyon hariç, diğer istasyonlarda yakalanan balık örneklerinde nonilfenol ve standart
alkilfenollerin ölçümleri sırasında tespit edilen alkilfenol ilintili maddeye rastlanmıştır Tablo
22
4. Ayrıca, Değirmenderesi ikinci istasyon olan Maçka’da kanalizasyon suyunda 1 saat
bekletilen gökkuşağı alabalıklarında da alkilfenol, nonilfenol ve nonilfenol ilintili maddelere
rastlanmıştır Tablo 4.
Alkilfenol etoksilat bileşiklerinin Japon balıkları üzerindeki etkileri de araştırılmıştır.
Laboratuardaki ön çalışmalarımız, Japon balıklarının nonilfenolü çok hızlı bir şekilde
vücutlarına aldığını (Tablo 5). Nonilfenolün, sudan Japon balıklarının dokularına geçişi doza
bağlı olarak artmakta ve çok kısa bir sürede balıklarda ölüme neden olmaktadır. Düşük
konsantrasyonda nonilfenolün balık dokusuna geçişi azalmaktadır. Balıklar düşük dozlarda
daha uzun yaşamaktadırlar. Bu konu üzerinde daha detaylı çalışma yapılması gerekmektedir.
Yukarıda da bahsedildiği gibi API, standart alkilfenol ölçümlerinin hepsinde görülen ve
HPLC’deki tutulma zamanı 37 dakika olan bir maddedir. Bu maddenin ne olduğu
bilinmemektedir. Ancak, alkilfenollerin etoksi ünitesi olma ihtimali büyüktür. Ahel et al.
(1985) rapor etmiştir ki, ticari olarak elde edilen nonilfenol gibi alkilfenol türevleri, saf
değildir. Örneğin, ticari olarak Aldrich firmasından elde edilen nonilfenolün, etoksi ünitesine
sahip nonilfenol etoksilat hatta oktilfenol ve oktilfenol etoksilat içerdiği rapor edilmektedir
(Ahel ve Giger, 1985).
Tablo 5. Değişik nonilfenol konsantrasyonlarına maruz bırakılan, Japon balıklarının yaşama
süresi ve dokularındaki nonilfenol brikiminin HPLC ile ölçümü
Nonilfenol
Konsantrasyonu
(mg/L)
Kullanılan
Balık Sayısı
Balığın yaşama
Nonilfenolün Balıkta
birikimi (g/g doku
süresi (dakika)
API
peak alanı SE
SE)
kontrol
3
1440*
0
0
220
3
10
9.15  0.16
6658 97.9
22
3
30
6.58  0.91
6312144.5
2.2
3
180
5.62  0.51
61613.95
0.22
3
1440*
0.95  0.29
607648.5
Histoloji
Değirmenderesi, Maçka çıkışından, Esiroğlu'ndan ve Sakarya nehri üzerinden alınan
ikişer balıkta histoloji yapıldı. Gonadlarında herhangi bir patolojik bozukluğa rastlanmamıştır.
23
Akvaryumda yapılan toksikoloji deneyinde, nonilfenolün balık karaciğerlerine zamana
bağlı olarak zarar verdiği ortaya konmuştur. Şekil 8 ve 9’da nonilfenole karaciğer dokusunun
histolojik resimleri görülmektedir. Nonilfenole (220µg/L) bir hafta maruz kalan gökkuşağı
alabalığının karaciğerinde Kupffer hücrelerinin arttığı görülmektedir (Şekil 9). Bir haftadan
daha uzun süre nonilfenole maruz kalan balıkların karaciğerinde hücre ölümü, retikülo endotel
hücrelerinde hipertrofi, hemoraji meydana gelmektedir (Şekil 10).
24
Karaciğerdeki glutatyon –S-transferaz (GST) enzim aktiviteleri
Tablo 3’de görüldüğü gibi, 220 g/L nonilfenole bir hafta maruz kalan balıklarda GST
enzim aktivitesi, yükselmektedir. Bu yükselme Tukey’in HSD istatistik yöntemine göre
anlamlıdır (p<0.05). Aynı konsantrasyona iki ve üç hafta kalan balıkların karaciğerinde ise
GST enzim aktivitesi düşmektedir. GST aktivitesindeki bu düşmede, istatistiksel olarak
anlamlıdır. Kontrol ve 66 g/L nonilfenol maruz bırakılan balıklarda, ikinci haftadan sonra
GST enzim aktivitesinde bir artma meydana gelmektedir. Kontrol grubunda meydan gelen
yükselme istatisksel olarak anlamlı değildir. Fakat, 66 g/L nonilfenol grubundaki balıkların
karaciğerinde, GST enzim aktivitesinde meydana gelen yükselme istatistiksel olarak
anlamlıdır (p<0.05).
AĞIR METAL ANALİZLERİ
24-25 ARALIK 1998 I. ÇALIŞMADA TOPLANAN ÖRNEKLERDE ÖLÇÜLEN KADMİYUM DEĞERLERİ:
ÖRNEK TÜRÜ:
İSTASYON ADI,
SIRA NO:

1-Değirmen Dere
Kontrol
SEDİMAN
SU
1.paralel
BALIK
2.paralel 3.paralel 1.paralel 2.paralel 3.paralel 1.paralel 2.paralel
3.paralel
0,3004gr 0,3084gr 0,3038gr
Ort. Cd+2 (ppb)
2-Değirmen Dere
Maçka Çıkışı
0,3031gr 0,3008gr 0,3017gr
Ort. Cd+2 (ppb)
3-Değirmen Dere
Esiroğlu
0,3085gr 0,3006gr 0,3027gr
Ort. Cd+2 (ppb)
4-Değirmen Dere
sanayi Sitesi
0,2005gr
___
___
Ort. Cd+2 (ppb)
5-Değirmen Dere
A. (10 m.derinlik)
0,3041gr 0,3030gr 0,3029gr
Ort. Cd+2 (ppb)
6-Değirmen Dere
A.(30 m.Derinlik)
0,3000gr 0,3189gr 0,3685gr
25
yok
yok
yok
___
____
____
yok
Yok
yok
___
___
___
yok
yok
yok
___
___
___
yok
yok
yok
___
___
___
yok
yok
Yok
___
___
___
ÖRNEK TÜRÜ:
İSTASYON ADI,
SIRA NO:

SEDİMAN
SU
1.paralel
BALIK
2.paralel 3.paralel 1.paralel 2.paralel 3.paralel 1.paralel 2.paralel
Ort. Cd+2 (ppb)
3.paralel
Örn. No
Yaş
T. Boy
Cinsiyet
1
Kara
Ciğer
Gonat
14,4cm
Erkek
0,212gr
0,3901gr
2
15,3cm
Dişi
0,4876gr 0,3250gr
3
14,4cm
Erkek
0,4598gr 0,3158gr
4
13,7cm
Erkek
0,2452gr 0,2557gr
5
15,0cm
Erkek
0,5474gr 0,3863gr
6
14,7cm
Erkek
0,4389gr O,5605gr
7
14,5cm
Dişi
0,3526gr
0,3428gr
8
18,0cm
Dişi
26
0,6968gr 0,6980gr
ÖRNEK
TÜRÜ:
İSTASYON ADI,
SIRA NO:
1.paralel

7-Değirmen Dere
A. (60m.-Yüzey)
SEDİMAN
SU
BALIK
2.paralel 3.paralel 1.paralel 2.paralel 3.paralel 1.paralel 2.paralel
3.paralel
yok
yok
yok
Ort. Cd+2 (ppb)
___
___
___
8-Değirmen Dere
A. (60m-30m)
yok
yok
yok
Ort. Cd+2 (ppb)
___
___
___
yok
yok
yok
___
___
___
9-Değirmen Dere
A. (60m-60m)
0,3208gr 0,3047g 0,3101gr
Ort. Cd+2 (ppb)
27
SONUÇ
Sakarya Nehri ve Değirmen deresi üzerinden toplanan su örneklerinde alkilfenol
rastlanmamıştır. Ancak, sediman ve balık örneklerinde alkilfenollere rastlanmıştır. Bu
sonuçlar literatürle uyumludur. Çünkü, alkilfenoller hidrofobik (su çözünmeyen) ve lipofilik
(yağda çözünen) özelliklerinden dolayı, sularda değil, sediman ve suda yaşayan canlılarda
birikmektedir (Tablo 4).
Sakarya nehri üzerinde Porsuk Çayı, Değirmendere üzerinde ise Maçka’dan alınan
sediman örneklerinde alkilfenole rastlanmıştır. Değirmendere, Maçka’da nonilfenol ve
bütilfenole rastlanmış, Porsuk Çayında ise sadece bütilfenol ölçülmüştür. Porsuk Çayı’ndan
alınan sediman örneğinde, Değirmenderesi, Maçka’dan alınan sediman örneğinden daha
düşük alkilfenol bulunmasının muhtemel nedenleri: 1) Maçka’dan alınan sediman örneği,
kanalizasyonun suya Değirmendereye akıtıldığı bölgeye daha yakın olması. 2) Porsuk
Çayı’ndan alınan sediman örneğinde alkilfenol özütleme veriminin çok düşük olmasıdır.
Porsuk Çayı, Değirmenderesine oranla çok daha fazla ağır metal kirlenmesine neden
olmaktadır. Ağır metallerin, metanol ile özütleme yöntemine etkisinin araştırılması
gerekmektedir. Örneğin, Kadmiyum, nonilfenolün canlı organizma tarafından tutulmasını
inhibe etmektedir. Sediman içerisinden özütleme de böyle bir etkileşimin olup olmadığı
bilinmemektedir.
Sakarya nehri ve Değirmenderesi üzerinden alınan sediman örneklerinin bazılarında
alkilfenollere rastlanmamasının bir nedeni de, bazı istasyonlarda sediman alınamaması ya da
su sıcaklığının 20 ºC üzerinde olması. Örneğin, Değirmenderesi, Sanayi sitesinde, sediman
örneği alınamamıştır. Sediman yerine kum alınabilmiştir. Trabzon’unun kanalizasyon
atıklarının atıldığı nokta olduğu için, örneklemenin oradan yapılması gerekmekteydi. Ancak,
Değirmenderenin denize boşaldığı yer olduğu için, sediman değil kum alınabilmiştir. Kum
örneğinde alkilfenol ölçülememiştir.
Bütün bunlara rağmen, alkilfenollerin balık dokularında ölçülmesi, nehirlerimizde
alkilfenol varlığını göstermektedir. Gerek literatür gerekse laboratuar çalışmalarımız
göstermektedir ki, alkilfenoller ve özellikle nonilfenol canlı dokularda biyolojik birikime
neden olmaktadır. Biyolojik birikim, biokonsantrasyon faktörü olarak ölçülmektedir ve
dokularda ölçülen alkilfenol miktarının, sudaki miktarına oranı olarak hesap edilmektedir.
Literatürde biokonsantrasyon faktörünün 1 ile 1000 arasında değiştiği rapor edilmektedir.
Laboratuarda yapılan deneylerde ise nonilfenolün, balıkların karaciğerinde patolojik (Şekil 810) ve biyokimyasal bozukluklara neden olduğu ortaya konmuştur.
29
ÖZET
Deniz ve Akarsularda Kirliliğin Karadeniz’deki Ekonomik Değeri Yüksek Balıkların
Stok ve Üremesi Üzerine Olan Etkisinin Belirlenmesi
Alkilfenol ethoxylate bileşikleri deterjanlarda, boyalarda, pestisidlerde ve plastik
eşyalarda kullanılan katkı maddeleridir. Bu bileşiklerin dünyadaki toplam üretim miktarının %
60’dan fazlası kanalizasyon ve endüstriyel atıklarla sularda toplanmaktadır. Alkilfenol
bileşikleri sularda alkilfenol türevlerine dönüşmektedir. Bu türevlerin balıklar üzerinde
östrojenik etkileri vardır ve bundan dolayı balıkların hormonal dengesinde ve üremesinde
ciddi bozukluklara neden olmaktadır. Kadmiyum ise balıklar için toksik ve endokrine sistemi
bozucu bir madde olup, endüstriyel atıklarla sulara karışmaktadır. Tatlı ve tuzlu su
balıkçılığımızda önemli bir yer tutan Karadeniz Bölgesine has balık stoklarımızın çevre
kirliliğine bağlı olarak gittikçe azaldığı gözlenmektedir.
Araştırmalarımızda, balık stoklarımız için ciddi bir tehdit oluşturan alkilfenol türevleri
ve kadmiyumun, Karadeniz Bölgesindeki akarsularımızda kirlilik oranları, ekotoksikolojik
çalışmalarla belirlenecektir. Bunun için, kanalizasyon ve endüstriyel atıkların yoğun olduğu
Trabzon’daki akarsular ve deniz kıyılarımızdan, su, sediment ve balık örnekleri alınarak,
ODTÜ Biyoloji Bölümü’nde alkilfenol; Trabzon Su Ürünleri Merkez Araştırma Enstitüsü’nde
ise kadmiyumun kirlilik seviyeleri ölçülecektir. Alkilfenol ölçümünde HPLC ve gaz
kromatografileri,
kadmiyum
ölçümünde
ise
atomik
absorbsiyon
spektrofotometresi
kullanılacaktır.
Araştırma bölgelerindeki balık yoğunluğu tespit edilecektir. Balık doku ve
organlarında histopatolojik incelemeler yapılarak, kirliliğin balık sağlığına ve üreme
organlarına verdiği tahribat araştırılacaktır. Sağlanabilecek ek ödeneğe bağlı olarak, balık
doku ve organlarındaki enzim seviyeleri, RFLP, vitellin miktarı ve DNA/RNA oranının tespiti
gibi detaylı araştırmalar da yapılabilecektir.
Ekotoksikolojik araştırmalar, gelişmiş ülkelerde çok yaygın ve kapsamlı olarak
yapılmaktadır. Araştırmalarımızda, balık stoklarımız için ciddi bir tehdit oluşturan alkilfenol
türevleri ve kadmiyumun, Karadeniz Bölgesindeki akarsularımızda kirlilik oranları
ekotoksikolojik çalışmalarla belirlenecektir. Balık doku ve organlarında histopatolojik
incelemeler yapılarak, kirliliğin balık sağlığına ve üreme organlarına verdiği tahribat
araştırılacaktır.
Alkilfenol ethoxylate bileşikleri deterjanlarda, boyalarda, pestisidlerde ve plastik
eşyalarda kullanılan katkı maddeleridir. Alkilfenol bileşikleri suda alkilfenol türevlerine
dönüşmektedir.Bu türevlerin balıklar üzerinde östrojenik etkileri vardır ve bundan dolayı
balıkların hormonal dengesinde ve üremesinde ciddi bozukluklara neden olmaktadır.
Kadmiyum ise balıklar için toksik ve endokrine sistemi bozucu bir madde olup, endüstriyel
atıklarla sulara karışmaktadır.
Bu çalışmada alkilfenol ve kadmiyumun neden olduğu kirlilik saptanacak ve bu
maddelerin canlı organizmadaki etkilerinin biyokimyasal ve moleküler mekanizmaları
açıklığa kavuşturulacaktır. Bu maddelerin kirliliğine bağlı olarak, DNA/RNA oranı
büyümesi(DNA miktarı sabit fakat gelişimin sekteye uğramasına bağlı olarak RNA
miktarında azalma olur) vitellin miktarının özellikle erkek balıklarda anormal miktarda
artması, enzimlerin düzeylerinde değişiklikler, üreme organlarında (Testis ve ovaryumlar)
anormal oluşumlar görülmesi beklenmektedir. Bu değişiklikler ve kirlilik miktarı arasında
korelasyon saptanması, su ürünlerini tehdit eden kirlilik seviyelerinin belirlenmesini
sağlayacaktır.
31
SUMMARY
A Research on the Effects of Sea and Fresh Water Pollution on the Stocks and
Reproduction of Economically Valuable Fishes in the Black Sea Region.
Alkylphenol ethoxylate compounds are used as additive substances of detergents,
paints, pesticides, plastic materials....etc. The production rate of these compounds is over
300,000 tons per year and more than 60% of this amount accumulates in waters via sewerage
and industrial wastes. In water, alkylphenol compounds transform into alkylphenol
derivatives. These derivatives have estrogenic effects on fishes and cause serious
abnormalities in their reproductive and hormonal systems. Cadmium is also toxic for fishes
and it harms their endocrine systems. Cadmium is carried to water by industrial wastes. A
decrease due to water pollution is observed in the population of fishes which are unique to
Black Sea region and vital to both freshwater and sea fishery.
Our ecotoxicologic researches aim to detect the pollution caused by the alkylphenol
derivatives and cadmium in the streams of Black Sea region. Sediment, fish and water
samples will be collected from the streams and coats of Trabzon where sewage and industrial
pollution is high. The pollution level of alkylphenol will be measured at the METU Biology
Department whereas that of cadmium will be measured at Trabzon Fisheries Central Research
Institute. HPLC and gas chromotography will be used for the detection of alkylphenols and
atomic absorbtion spectrophotometry will be used for the detection of cadmium.
Fish organs and tissues will be examined in order to detect harms of pollution on fish
health and gonads. More detailed researches such as the measurements of enzyme levels,
RFLP, amount of vitelline and DNA/RNA ratios in fish organs and tissues will be possible
depending on the extra appropriations that might be provided.
Ecotoxycological research have been made comprehensivelly and widespread in
developed countries. Our ecotoxycologic researches aim to detect the pollution caused by the
alkylphenol derivatives and cadmium in the streams of Black Sea Region. The demage on fish
health and reproductive systems which is couse water pollution will be determinated by using
hystopathologic methods in fish organs and tissues.
Alkylphenol ethoxylate compounds are used as additive substances of detergents,
paints, pesticides, plastic materials, etc. In water alkyphenol compounds transform into
alkyphenol derivatives. These derivatives have estrogenic effects on fishes and cause serious
abnormalyties in their reproductive and hormonal systems. Cadmium is also toxic for fishes
and it harms their endocrine systems. Cadmium is carried to water by industrial wastes.
In this study will be determinated alkylphenol and cadmium pollutions.This
compounds effects on living organizms and their biochemical and molecular mechanizms will
be understood.It is expected to seen that; according to number of these compounds pollution,
increasing of DNA/RNA ratio (the DNA amount is stable, but owing to demage of it’s
development RNA amount will be degrease.), amount of vitellin abnormally increase
especially male fish, changable enzym levels abnormally forming on it’s gonads (testis and
ovarium). The corelation between this changes and pollution amount will provide the
determination of pollution levels which is harmfull to water production
33
LİTERATÜR LİSTESİ
Blackburn, M.A., and Waldock, M.J. (1995).Concentrations of Alkylphenols in Rivers and
Estauries in England and Wales. Water Research, vol. 29. No 7, pp.1623-1629.
White, R., Jobling, S., Hoare, S.A., Sumpter, J.P. and Parker, M.G. (1994).
Environmentally Persistent Alkylphenolic Compounds are Estrogenic. Endocrynology,
vol. 135, No. 1, pp.175-182
Naylor, C.G., Mieure, J.P., Adams, W.J., Weeks, J.A., Castaldi, F.J., Ogle, L.D., and
Romano, R.R. (1992). Alkylphenol Ethoxylate in the Environment. Journal of
American Oil and Chemistry Society, vol. 69, No. 7, pp. 695-703.
Thuvander, A. (1989). Cadmium Exposure of Rainbow trout, Salmo Gairdneri
Richardson:Effects on Immune Functions. Journal of Fish Biology, vol. 35, pp. 521529.
Albergoni, V. and Viola, A. (1995). Effects of Cadmium on Catfish, Ictalurus meals,
humorial immune response. Fish and Shellfish Immunology. Vol. 5, pp. 89-95.
Pecheanu, I., ve Mihnea, R., (1986). Trace metals in the coastal marine waters from the
southern part of the Romanian Black Sea coast, Rapp. P.-V. Réun. CIESM, 30 (2)
(1986) 129.
Ross, A.D., The Black Sea and the Sea of Azov, Ocean Basins and Margins, Vol 4A, The
Eastern Mediterranean, (ed: A.E.M. Nairn ve ark.), Plenum Press, New York, 1977,
445-81.
Sorakin, Y.I., The Black Sea in Ecosystems of the World, Vol. 26. Estuaries and Enclosed
Seas, (ed: P.H. Ketchum), Elsevier Sc., Amsterdam, 1983, 253-91.
Tolmazin, P., Changing Coastal Oceanography of the Black Sea, Prog. Oceonog., Vol-15
(1985) 217-276-277-316.
Tuğrul, S., Baştürk, Ö., Saydam, C., ve Yılmaz, A., Nature, 359 (1992) 137-139.
Zenkevitch. L., Biology of the Seas of the U.S.S.R., George Allen and Unwin Ltd., London.
1963.